向小鼠导入α-1，3-GT沉默基因及其整合效果的研究

论文摘要

为了沉默α-1,3-半乳糖苷转移酶,在已报道的shRNA序列前加上人类H1启动子,设计一段沉默小鼠α-1,3-GT基因的siRNA序列。针对该序列分段设计引物,完全采用PCR法将其连接起来,再把该序列克隆到pGEM-T载体中,构建出针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性沉默载体。将其酶切线性化后通过显微注射法导入小鼠受精卵中,然后进行胚胎移植。最后利用PCR和Southern blot对出生仔鼠进行了外源基因的整合检测。该研究为获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了重要基础。1、经PCR法和测序验证,已经顺利用两步PCR法将设计的引物连接起来,并成功的克隆进入pGEM-T载体中。2、利用显微注射法将线性化的α-1,3-GT基因沉默载体导入2846枚小鼠受精卵中,得到可移胚2291枚,将其移入76只受体母鼠,其中有35只母鼠妊娠,妊娠率为46.1%。在母鼠妊娠过程中,前后有29只母鼠流产,未流产的6只妊娠小鼠产仔21只。3、在显微注射时,观察了胚胎移植数及不同细胞期对产仔率的影响。结果表明:受体小鼠移植21枚30枚显微注射胚可以获得较高的产仔率;移植二细胞期的受体小鼠妊娠率及产仔率明显高于移植一细胞期卵的受体小鼠。4、利用PCR和Southern blot对21只活鼠和17个死鼠（包括死胎、木乃伊）进行了外源基因的整合检测,一共检测到7个阳性个体（三只活鼠,其它为死胎、木乃伊）,外源基因整合率为14.3%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 RNA 干扰技术研究进展
• 1.1.1 RNA 干扰的研究历史
• 1.1.2 RNA 干扰的分子机制
• 1.1.3 RNA 干扰的生理功能
• 1.1.4 RNA 干扰的实现方法
• 1.1.5 RNA 干扰的应用领域
• 1.1.6 哺乳动物RNA 干扰技术的发展
• 1.1.7 RNA 干扰领域的未来趋势
• 1.2 转基因动物技术研究进展
• 1.2.1 转基因动物制备的几种方法
• 1.2.2 提高转基因效率的策略
• 1.2.3 转基因动物技术在畜牧生产中的应用
• 1.3 本研究的目的与意义
• 第二章 小鼠Α-1,3-GT 基因沉默载体的构建及其线性化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器和试剂
• 2.1.2 α-1,3-GT shRNA 沉默基因的设计
• 2.1.3 沉默基因的片段化合成
• 2.1.4 沉默基因的PCR 连接及扩增
• 2.1.5 连接及转化
• 2.1.6 重组子的筛选及鉴定
• 2.1.7 Apal I 酶切使其线性化
• 2.2 结果
• 2.2.1 PCR 法连接合成条件的优化及结果鉴定
• 2.2.2 重组子的鉴定
• 2.2.3 Apal I 酶切
• 2.3 讨论
• 2.3.1 干扰载体设计中启动子的选择
• 2.3.2 沉默基因的PCR 法合成
• 2.3.3 RNA 干扰技术是基因敲除方法的进一步发展
• 2.4 小结
• 第三章 显微注射法向小鼠导入Α-1,3-GT 沉默基因
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 器材的准备
• 3.1.2 小鼠的超数排卵和假孕母鼠的制备
• 3.1.3 原核胚的获取
• 3.1.4 受精卵的培养
• 3.1.5 原核胚的显微注射
• 3.1.6 胚胎移植-伞口植入法
• 3.1.7 助产与出生
• 3.1.8 数据分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 显微注射和胚胎移植的试验结果
• 3.2.2 移入胚胎数对小鼠受孕率和产仔率的影响
• 3.2.3 一细胞期与二细胞期胚胎对移植成功率的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 显微操作和胚胎移植中应当注意的问题
• 3.3.2 影响转基因小鼠原核胚发育的因素
• 3.4 小结
• 第四章 Α-1,3-GT 沉默基因在仔鼠体内的整合检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验样品
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要试剂及缓冲液的配制
• 4.1.5 组织DNA 的提取
• 4.1.6 PCR 检测
• 4.1.7 DNA 探针的制备
• 4.1.8 Southern 印迹杂交法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 PCR 检测结果
• 4.2.2 基因组Southern 杂交检测结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介