食品中弧菌免疫学筛检方法建立研究

论文摘要

食物中毒菌的检测一直是食品安全领域的热点问题,随着海水养殖业的蓬勃发展,由致病性弧菌造成的食物中毒病例频繁发生。现行的弧菌检测方法要么针对样品单一、耗时费力;要么检测试剂昂贵,不利于推广。因此,建立一种广谱快速、低耗高效、灵敏便捷的弧菌筛检方法尤为重要。本研究旨在找到弧菌属细菌的共同抗原,以此抗原为靶标,建立可同步筛检多种弧菌的免疫学检测方法。弧菌外膜蛋白位于弧菌最外层,具有与外界广泛接触的机会;弧菌鞭毛主要由鞭毛丝蛋白组成,抗原性好,保守性高。这些特点使它们成为弧菌属细菌共同抗原的首选目标。OmpK为弧菌噬菌体KVP-40的受体,可能存在于多种海洋弧菌的外膜之中;鞭毛基因FlaA、FlaB、FlaF编码弧菌极鞭毛丝蛋白基因,鞭毛丝蛋白保守性高。首先,本实验从弧菌OmpK的基因入手,通过克隆获得5株弧菌标准株OmpK基因并测序比较,从分子水平证明OmpK基因为多种弧菌所共有。同时,本实验成功构建副溶血弧菌多联鞭毛丝蛋白结构基因F,通过PCR克隆获得副溶血弧菌鞭毛基因片段（FlaA﹑FlaB﹑FlaF）,用柔性Linker序列（Gly4Ser）进行串联,通过套叠PCR扩增出副溶血弧菌多联融合鞭毛基因F。其次,实验设计利用溶藻弧菌OmpK基因和多联融合基因F构建原核表达重组质粒pET22b-OmpK和pET22b-F,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下获得高效表达。之后,通过纯化两种重组蛋白分别免疫豚鼠和獭兔制备多抗血清,经ELISA检测两种多抗血清效价分别为1:51200和1:6400。两种多抗血清均可与多种弧菌发生反应而与非弧菌类食物中毒菌不识别,说明两种血清均具有较好的弧菌属特异性。利用纯化的多抗建立可同时筛选多种弧菌的抗原捕获ELISA方法;同时,利用重组表达的OmpK免疫BALB/c小鼠,制备抗外膜蛋白K的单克隆抗体,旨在筛选出具有弧菌属特异性的单克隆抗体,进而有针对性的定位弧菌属特异性的抗原表位,为以后的实验工作奠定基础。

论文目录

• 内容提要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第1章 弧菌鞭毛的研究进展
• 1.1 弧菌鞭毛的结构及组成
• 1.2 弧菌鞭毛的基因组成
• 1.3 弧菌鞭毛的功能
• 第2章 弧菌主要外膜蛋白的分子免疫学研究进展
• 2.1 弧菌外膜蛋白的组成及种类
• 2.2 弧菌外膜蛋白的免疫学特性
• 2.3 相关的蛋白、蛋白酶和细菌毒素
• 2.4 弧菌的主要外膜蛋白
• 2.5 外膜蛋白在诊断学方面的研究应用
• 2.6 前景与展望
• 第3章 病原性海洋弧菌检测方法的研究进展
• 3.1 核酸为基础的检测技术
• 3.2 免疫学为基础的检测技术
• 3.3 核酸与免疫学相结合的检测技术
• 第二篇 研究内容
• 第1章 五种弧菌OMPK基因的克隆及分析
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第2章 溶藻弧菌OMPK蛋白的表达和免疫特性
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第3章 副溶血弧菌鞭毛基因的克隆、串联及表达
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第4章 弧菌鞭毛多联融合蛋白、OMPK的免疫特性
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第5章 弧菌属细菌ELISA快速筛检方法的建立
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第6章 抗溶藻弧菌外膜蛋白K单克隆抗体的制备与鉴定
• 6.1 材料与方法
• 6.2 结果
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文及其它成果
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 导师简介