寻常型天疱疮抗原Dsg3基因的真核表达及在临床检测中的应用

论文摘要

前言寻常型天疱疮（Pemphigus vulgaris，PV）是一种慢性、复发性的大疱性皮肤病，以皮肤和粘膜出现水疱、大疱为特征。PV患者体内的自体反应性IgG与角质形成细胞表面结合，破坏了细胞间连接结构，导致细胞间连接的缺失，形成表皮内水疱。PV患者自身抗体的靶分子被证实是桥粒结构的一种成分—跨膜桥粒核心糖蛋白3（desmoglein，Dsg3），属于钙粘蛋白超家族的成员。从Dsg的氨基酸序列推论显示，它和钙依赖细胞黏附分子有同源性，而桥粒的跨膜糖蛋白Dsg1，也是落叶型天疱疮的自身抗原。和典型的钙粘素一样，PV抗原有5个大约相似的细胞外的结构域，称为EC1（氨基端）—EC5（羧基端）。通过X射线衍射晶体分析法显示钙粘蛋白的氨基末端的三维结构有一个重要的二聚体结构，称为二聚体链。虽然有很多粘连抑制性抗体被发现与EC1结合，但是很多粘连抑制性抗体和刺激性抗体也和其他的胞外段结合，包括EC5和EC3。另外，在一些人的组织中也发现有上皮细胞钙粘蛋白的EC2和EC3的自然突变的发生，在细胞外功能区的上皮细胞钙粘蛋白的钙离子结合部位的突变可以造成粘着功能的丧失。另外，用生理物理学直接测量钙粘蛋白外功能区分子力的研究还发现复杂的粘着物相互作用的证据，当外功能区完全重合时，粘着力最大。虽然没有研究证实特异性结合位点，仍然认为5个细胞外功能区在上皮细胞钙粘蛋白相互作用中起重要的作用。有人已经用杆状病毒表达系统获得人Dsg3重组蛋白质，包括Dsg3的整个细胞外功能区域，并已经过人PV患者血清的天然抗体证实。但是，哺乳动物表达系统在蛋白质加工方面比杆状病毒表达系统更高级，哺乳动物表达系统中的重组蛋白与其天然结构更加一致。这个研究中，应用哺乳动物表达系统，我们获得Dsg3整个编码区的重组体蛋白。我们关注PV患者血清和重组蛋白Dsg3的免疫反应性，并且被一组PV患者的血清证实。另外，我们想用重组的Dsg3细胞外功能区作为抗原，并用特殊的ELISA方法检测与这些抗原发生反应的抗体，可用于PV的临床检测。材料和方法一、病例和主要试剂1、PV患者组：PV患者40人均来自辽宁省内，其中男22名，女18名，年龄14～60岁，平均38岁±14岁，为中国医科大学附属第一医院皮肤科住院患者。所有病例均经临床、组织病理及免疫病理证实。正常对照组：本院健康献血者40名。2、质粒、菌株及细胞：真核质粒pcDNA3.1TM／myc-His（-）B由北京军事医学科学院张兆山教授惠赠。菌株TG1、人宫颈癌细胞系Hela细胞由中国医科大学病原微生物教研室提供。3、主要试剂：Ni-NTA purification system、脂质体转染试剂盒脂质LipofectamineTM 2000和G418（Geneticin）为美国Invitrogen公司产品，QIAprep Spin Miniprep Kit（提质粒试剂盒）为Qiagen公司产品，购自基因公司，胰蛋白酶（Trypsin）、RPMI1640培养基为美国Hyclone公司产品，限制性内切酶、碱性磷酸酶及T4 DNA连接酶、RNA easy Mini kit、Plasmid purification Miniprep kit试剂盒等分别购自Takara生物工程公司及Promega公司。4、主要仪器：二氧化碳培养箱；超净工作台；低温超速离心机；紫外分光光度计；自动凝胶电泳成像系统；通用电泳仪；-80℃深低温冰箱；显微镜。二、实验方法1、RNA模板的提取及cDNA的获得。2、Dsg3 EC1-EC5 cDNA片段的扩增、重组克隆的构建及鉴定。3、脂质体LipofectamineTM 2000介导的稳定转染Hela细胞。4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶蛋白电泳（SDS-PAGE）鉴定表达产物。5、重组蛋白质的纯化及Western-blot鉴定。6、重组Dsg3 EC1-EC5蛋白在临床的应用。实验结果一、重组质粒的构建和鉴定特异性引物对角朊细胞总RNA进行RT-PCR扩增，PCR产物测序后证实与Gene Bank登录的Dsg3 EC1-EC5序列完全一致。将PCR产物插入表达载体pcDNA301TM／myc-His（-）B后转入E．coli TG1，挑取在LB／Amp培养基上生长的细菌克隆，提取质粒，并用相应的限制性内切酶进行双酶切，分别切出目的基因片段和载体片段的克隆即为阳性克隆，命名为pcDNA3.1TM／myc-His（-）B-Dsg3。二、SDS-PAGE鉴定复合基因pcDNA3.1TM／myc-His（-）B-Dsg3在Hela细胞中表达的产物在重组质粒pcDNA3.1TM／myc-His（-）B-Dsg3稳定转染的Hela细胞中，pcDNA3.1TM／myc-His（-）B-Dsg3基因表达了分子质量单位约为66kDa的融合蛋白，未经质粒转染的Hela细胞、转染了pcDNA3.1TM／myc-His（-）B空质粒的细胞无此蛋白的表达。三、pcDNA3.1TM／myc-His（-）B-Dsg3复合基因表达产物的鉴定Western-blot显示复合基因pcDNA3.1TM／myc-His（-）B-Dsg3表达的66kDa融合蛋白带能被寻常型天疱疮患者血清中的IgG自身抗体识别。四、临床标本的检测纯化的重组蛋白Dsg-3 EC1-EC5应用ELISA的方法检测寻常型天疱疮患者的血清标本40份，检测的的阳性率95％（38／40），同时检测对照血清标本40份，所有的样本均为阴性，重组蛋白未现假阳性反应。讨论寻常性天疱疮患者体内有作用于角质形成细胞表面的循环抗体，在PV中，自身抗体的主要靶目标是Dsg3。由杆状病毒表达的人Dsg3的重组胞外段的研究使PV自身抗体的致病机制更明确。这次研究的目的是用哺乳动物表达系统克隆Dsg3整个的编码区，并形成一个新的哺乳动物重组蛋白来代表Dsg3的整个细胞外区域，这也是用来证实PV特征抗体的一个有价值的工具。天疱疮抗原cDNA的成功克隆使天疱疮研究进入了一个新的阶段，并将直接导致对这些疾病的病理生理学的进一步理解。在这个研究中，目的在于获得PV抗原的重组蛋白，这些蛋白可以吸收PV患者血清中的致病抗体。以前研究中获得的PV抗原的细菌融合蛋白仅代表顺序表位，不能吸收PV患者血清中致病的抗体。随后，Amagai通过杆状病毒用COS7细胞和Sf9昆虫细胞，构造一个PVA整个胞外段的嵌合分子，具有人IgG1（称为PV Ig）恒定段尾巴。而通过哺乳动物表达系统获得重组体融合蛋白，和杆状病毒表达系统相比，哺乳动物表达系统对重组蛋白的修饰和处理更加有效。因此，我们尝试在哺乳动物表达系统中获得PVA重组蛋白，这样可以介导翻译后修饰成分，如糖基化、蛋白水解加工和蛋白折叠。和以前的重组Dsg3蛋白相比，哺乳动物细胞获得的重组蛋白更容易纯化，及包含更多的天然抗原决定簇。具有天然构象的重组天疱疮抗原，使我们可以把ELIEA作为有较高敏感性和特异性的工具用于天疱疮诊断中。ELIEA研究发现粘膜优势型PV患者血清主要与Dsg3反应。以多种动物和人组织作底物的常规免疫荧光试验常用于诊断天疱疮，了解天疱疮患者的活动度。但是，常规免疫荧光试验不能定性的区别Dsg3和Dsg1的抗体和其他的抗体。Dsg3的使用可以精确定性与PV特异性抗原反应的抗体。虽然免疫印记技术的多种抗原也能达到这个目的，但ELISA更好一些，因其可以直接检测作用于Dsg3分子的抗体。概括地说，我们把重组的天疱疮抗原用于ELISA，该抗原提供了一个敏感性和特异性都具备的工具用于PV患者的评估。这个有用的诊断工具不仅可以用于临床检测，还可用于PV患者的抗体特征性的反应，了解PV的基本免疫病理学机制。结论真核表达的Dsg3 EC1-EC5蛋白与寻常型天疱疮患者血清中的抗体发生反应特异性反应，更接近自然状态下寻常型天疱疮抗原，可作为PV诊断及病情评估的依据。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介