醛糖还原酶、钠钾二氯协同转运体与血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶在肾细胞中关系的研究

论文摘要

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病慢性并发症(DCC)中的一种,它是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)致死致残的主要原因。据统计,30%～40%的Ⅰ型糖尿病患者和40%的Ⅱ型糖尿病患者并发糖尿病肾病,可由最初出现蛋白尿发展到高血压、肾病综合症,最终导致肾衰和死亡,DN的3年生存率仅为50%左右。糖代谢的多元醇通路与糖尿病血管病变、肾脏病变、视网膜病变及外周神经病变等糖尿病慢性并发症密切相关。而醛糖还原酶(Aldose reductase AR)是多元醇糖代谢支路的限速酶,因此,AR活性的增高可能是导致DN的主要原因之一。醛糖还原酶是组成多元醇糖代谢支路的两个酶中的第一个,也是这个糖代谢途径的限速酶,负责以NADPH为辅助因子还原葡萄糖为山梨醇。在肾里面,AR在内髓层(inner medulla)有高度的表达,以便利用葡萄糖大量制造山梨醇。后者为肾组织中重要的有机渗透压相容质(organic osmolyte),用于保护肾收集管细胞免受高渗透压损伤。持续的高血糖是糖尿病肾病的主要发病因素,高血糖可以通过某些丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶导致肾小球系膜区基质扩张和系膜细胞增殖。血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶(serum and glucocorticoid inducible protein kinase,SGK)是一种新发现的丝/苏氨酸蛋白激酶,它有SGK1、SGK2和SGK3 3种亚型。与其他蛋白激酶主要在酶活性水平上受翻译后的磷酸化和去磷酸化调控显著不同的是,SGK1的转录、活性以及亚细胞定位受到不同胞内和胞外刺激因素的调节,是多种胞内信号途径的功能性交汇点,参与了细胞增殖、渗透调节、离子通道调节以及细胞生存和/或凋亡应答等过程。SGK1 mRNA在糖尿病患者肾脏中的表达显著高于正常人,因而SGK1可能参与糖尿病肾病的发生。钠钾二氯协同转运体(The sodium/potassium/2 chloride cotransporter type 2,NKCC2)是一种细胞膜蛋白,特异性的表达在肾组织中。它有NKCC2A、NKCC2B和NKCC2F三种亚型。它在肾中定位在髓袢厚上升支上皮膜上,参与钠的主动运输,把钠从肾的管腔转运到基液中,使钠在髓质管腔的间隙大量聚积,产生了高渗透压,而这种高渗透压是肾髓质区域的一个重要的信号。然而,关于AR、NKCC2与SGK1之间是否存在关系的研究迄今仍未见报道。我们构建了带有小鼠AR、NKCC2基因的重组腺病毒并将其感染mIMCD3细胞,通过western blot、免疫细胞化学等技术进行AR、NKCC2与SGK1的关系研究。结果发现:在体外培养的mIMCD3细胞内过量表达了AR后,SGK1的表达得到了显著的提高。另外,通过免疫组织化学手段也发现了AR基因敲除小鼠的肾组织中SGK1表达明显下降,而在AR双转基因小鼠的肾脏中SGK1的表达又有了一定的恢复。说明肾细胞内SGK1的表达受到AR的正调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 引言
• 1.2 AR的结构
• 1.3 AR在肾中的渗透调节功能
• 1.4 AR与糖尿病
• 1.5 SGK的发现
• 1.6 SGK1的结构
• 1.7 SGK1的生物学功能
• 1.7.1 SGK1调节离子通道的功能
• 1.7.2 SGK1抑制细胞凋亡的功能
• 1.7.3 SGK1与糖尿病
• 1.8 AR与SGK1的关系
• 1.9 AR基因剔除小鼠和AR双转基因小鼠
• 1.10 NKCC2在肾的渗透调节中的作用
• 1.11 本文研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重组质粒pFLAG-CMV2-mNKCC2的构建
• 2.2.2 重组腺病毒质粒pAdEasy-1-mAR的构建及纯化实验
• 2.2.3 重组腺病毒质粒pAdEasy-1-mAR的包装、纯化和感染
• 2.2.4 细胞培养
• 2.2.5 细胞的脂质体转染
• 2.2.6 蛋白提取与Western blot
• 2.2.7 免疫细胞化学
• 2.2.8 实验动物组织处理
• 2.2.9 免疫组织化学
• 3 实验结果
• 3.1 NKCC2对SGK1的影响
• 3.2 AR对SGK1的影响
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢