嗜盐脂肪酶产生菌的筛选、酶学性质及基因组文库的初步构建

论文摘要

极端环境微生物以其特殊的生理机能适应了高温、低温、高酸碱度、高盐、高压等恶劣生存条件,独特的生存环境形成了其特有的代谢方式并能够产生许多具有特殊功能的生物活性物质,如极端酶及抗生素等,它们在医药、食品、农业、化工、环保等领域有着重要的应用前景。从内蒙古锡林浩特地区盐湖菌种样品中筛选到一株嗜盐脂肪酶高产菌Z4,Z4菌株为革兰氏阴性杆菌,生长温度范围为3060℃,最适生长温度为42℃,生长NaCl范围0.55 mol/L,最适生长NaCl浓度为3.5 mol/L。结合生理生化特征和16S rDNA序列分析结果,将其鉴定命名为Haloterrigena thermotolerans Z4,属于嗜盐耐热古生菌。Z4菌株的产酶属于生长耦联型,其最适产酶条件为pH 8.0、50℃和NaCl 3.5 mol/L;Z4菌株可以利用多种诱导物产酶,添加1%橄榄油作为诱导物产酶效果最好。以p-NPB为底物对Z4菌株所产脂肪酶性质进行了研究,结果显示:金属离子Ba2+、Fe2+和Cu2+对酶具有激活作用,酶活不同程度地提高了2030%;受PMSF的完全抑制;该酶受到EDTA、SDS和DMSO的抑制,酶活不同程度地下降了2030%;该酶对NaCl有较高的依赖专一性,在无盐条件下发生不可逆变性,至少需要0.5 mol/L NaCl维持活性,并且高浓度NaCl对于提高其热稳定性有一定作用。醇类物质对于提高酶的热稳定性有一定作用,丙三醇效果最好。该酶对短链底物p-NPB（对硝基苯酚丁酸酯）最适水解条件为:pH 8.0、70℃、3.5 mol/L NaCl,水解活力为14 U/mL;对长链底物p-NPP（对硝基苯酚十六酸酯）最适水解条件为:pH 8.0、80℃、2.5 mol/L NaCl,水解活力为13 U/mL。同时本文尝试构建了嗜盐菌基因组文库,为筛选嗜盐脂肪酶基因工作奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 极端微生物
• 1.2 嗜盐菌
• 1.2.1 嗜盐菌概述
• 1.2.2 嗜盐菌嗜盐机理
• 1.2.3 嗜盐菌在生物技术中的应用
• 1.3 嗜盐酶
• 1.3.1 嗜盐酶的组成及结构特点
• 1.3.2 嗜盐酶的应用
• 1.4 本课题的意义和研究内容
• 第二章 嗜盐脂肪酶产生菌的筛选鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 实验设备及仪器
• 2.2.4 脂肪酶产生菌的筛选
• 2.2.5 脂肪酶酶活测定
• 2.2.6 生理生化特性
• 2.2.7 16S rDNA序列分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 脂肪酶高产菌株的筛选及分离
• 2.3.2 菌株形态观察及摇瓶复筛
• 2.3.3 Z4 菌株生理生化特征
• 2.3.4 16S rDNA 序列分析及系统发育树的构建
• 2.4 结论
• 第三章 嗜盐菌产酶条件及粗酶性质研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 摇瓶培养方法
• 3.2.4 粗酶液制备方法
• 3.2.5 产酶条件研究
• 3.2.6 粗酶性质研究
• 3.3 结果
• 3.3.1 产酶条件研究
• 3.3.2 酶学性质初步研究
• 3.4 讨论
• 3.4.1 培养基pH对发酵产酶的影响
• 3.4.2 培养温度的选择
• 3.4.3 嗜盐脂肪酶特性
• 3.5 结论
• 第四章 Haloterrigena thermotolerans Z4基因组文库的初步构建
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 工具酶和化学试剂
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 嗜盐古菌染色体提取及酶切
• 4.2.5 质粒提取、酶切及去磷酸化
• 4.2.6 末端半补齐反应
• 4.2.7 载体与片断的连接
• 4.2.8 电转化法感受态细胞的制备与转化
• 4.2.9 化学转化法感受态细胞的制备与转化
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 基因组染色体的提纯与酶切
• 4.3.2 不同策略的效果比较
• 4.3.3 文库评价及重组质粒鉴定
• 4.4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文