TEAD1基因功能研究及其新的转录调控靶基因的鉴定

论文摘要

TEAD1 （TEA domain family member 1）是调节肌肉特异基因表达的重要转录因子,其含有一个可与肌肉特异的顺式作用元件M-CAT结合的TEA结构域,可调控多个肌肉特异表达基因,在肌肉的发育过程中起重要的调控作用。TEADl家族在心肌发育、心肌肥大、心率失常、平滑肌的发育、成肌细胞形成、骨骼肌肥大和再生以及神经脊的发育过程中有至关重要的作用。基因转录水平的调控是影响蛋白丰度和蛋白功能的重要过程,反式作用因子与顺式作用元件相互作用是实现基因转录调控的主要方式。转录因子对基因表达的调控具有“一对多”的特征,而以往对转录因子TEAD1基因的研究只关注了其对单个靶基因的调控,缺乏全基因组范围内TEAD1的靶基因筛选。本研究是实验室前期研究的深入和拓展,前期研究发现TEAD1基因在猪的胚胎发育过程中呈上调表达,且其5’非翻译区的一个突变位点与猪的平均日增重显著相关。本实验室邱海芳博士运用CHIP-on-chip技术在小鼠肌肉中高通量的筛选了TEAD1可能调控的靶基因,发现存在745个潜在的受TEAD1调控的基因。本研究是以小鼠为研究模型,在芯片数据的基础上,通过生物信息学分析、启动子分析、表达量分析和EMSA实验等开展TEAD1调控的新的靶基因鉴定和验证,并对靶基因的功能和表达调控进行了初步的探讨。首次进行了TEAD1的时空表达研究,并通过基因超表达的方法在C2C12细胞中进行了TEAD1基因的功能研究。通过严谨的实验设计和一系列的实验,本研究得到了以下结果：1 TEAD1基因的功能：利用半定量RT-PCR检测了TEAD1基因在小鼠各个组织中的表达情况,结果显示该基因在小鼠各个组织中均有较高水平的表达；荧光定量PCR检测TEADl基因在C2C12细胞不同分化时期的表达量,发现随着分化时间的延长,TEAD1基因呈上调表达；在C2C12细胞进行了有效的超表达后,采用流式细胞术检测细胞周期,发现细胞周期无显著变化；在小鼠C2C12细胞超表达TEADl基因,荧光定量PCR检测C2C12细胞分化标记基因Myh4的表达,发现TEAD1基因的超表达可引起Myh4基因表达量的上调。以上综合说明了TEAD1基因可能参与了C2C1细胞的分化而不影响细胞的增殖。2靶基因验证结果：用生物信息学软件TESS分析,发现Mrpl21、Ndufa6, Ccne1、Ankrd42基因的启动子区域都包含有TEAD1蛋白的结合位点；C2C12细胞中超表达TEAD1后,荧光定量PCR检测候选靶基因Mrpl21, Ndufa6、Ccnel、Ankrd42基因的表达量,发现Ankrd42表达量上调,而Ndufa6和Ccnel基因的表达量下调；将TEAD1的超表达载体与靶基因启动子载体共同转染C2C12细胞,测定基因启动子活性,与对照组（空载体与启动子载体共同转染C2C12细胞）相比,Mrpl21和Ankrd42基因的启动子活性显著上升,而Ndufa6、Ccne1基因的启动子活性显著下降；体外的EMSA实验直接证实了TEAD1与Mrpl21和Ndufa6基因探针的结合,而TEADl蛋白不能与Ankrd42基因特异的探针直接结合。说明TEAD1可直接调控Mrpl21和Ndufa6基因的表达,而对Ankrd42启动子活性和表达量的影响是间接的。TEAD1是否直接调控Ccnel基因需要进一步实验验证。3靶基因相关功能初步研究：在C2C12细胞不同分化时期检测了Mrpl21、Ndufa6、Ccnel基因的表达趋势,发现Mrpl21和Ndufa6两个基因呈显著上调表达,而Ccnel基因在分化过程中呈显著下调表达。初步推测这三个基因可能参与了C2C12细胞的分化过程。4构建了Mrpl21基因启动子长度突变体载体,在增殖和分化的C2C12细胞中检测了各个长度突变体的活性,发现各段启动子在分化期比在增殖期有更高的活性,且含有结合位点的突变体比没有结合位点的突变体有更高的活性。以上的研究揭示了转录因子TEAD1在C2C12细胞分化过程中的功能,并验证了2个新的直接受TEAD1基因调控的靶基因Mrpl21和Ndufa6和1个间接受TEAD1调控的靶基因Ankrd42, TEAD1对Ccnel是否为直接调控还有待进一步的EMSA实验证实。本研究加深了对TEAD1功能的认识,发现了其调控的新的靶基因,研究结果为肌肉的发育过程中基因的调控提供了依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 研究问题的由来
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 骨骼肌的发育过程
• 1.2.2 调节骨骼肌发育的重要转录因子
• 1.2.3 转录因子TEAD1家族的调控作用
• 1.2.4 CHIP-on-chip筛选出的TEAD1的靶基因分析
• 1.2.5 基因转录水平调控的研究方法
• 1.2.5.1 基因顺式作用元件的研究方法
• 1.2.5.2 DNA-蛋白质互作的研究方法
• 1.3 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 细胞系、菌株和载体
• 2.1.3 主要试剂及配制
• 2.1.3.1 购买试剂、耗材及技术服务
• 2.1.3.2 配制试剂
• 2.1.4 实验所需仪器设备
• 2.1.5 生物信息学分析网站及软件
• 2.2 方法
• 2.2.1 本研究的技术路线
• 2.2.2 生物信息学分析
• 2.2.3 DNA,RNA和cDNA样品的制备
• 2.2.3.1 小鼠肌肉组织DNA的提取
• 2.2.3.2 组织和细胞RNA的提取
• 2.2.4 超表达载体和启动子载体构建
• 2.2.4.1 TEAD1超表达载体的构建
• 2.2.4.2 靶基因启动子载体的构建
• 2.2.5 目标基因的表达量检测
• 2.2.5.1 小鼠TEAD1基因的组织表达谱
• 2.2.5.2 靶基因表达量检测
• 2.2.6 细胞培养及转染
• 2.2.6.1 细胞复苏
• 2.2.6.2 细胞培养
• 2.2.6.3 细胞转染
• 2.2.6.4 细胞冻存
• 2.2.7 细胞周期检测方法
• 2.2.8 靶基因启动子活性测定
• 2.2.9 凝胶迁移实验（EMSA）
• 2.2.9.1 靶基因探针的设计
• 2.2.9.2 小鼠肌肉细胞核蛋白的提取
• 2.2.9.3 EMSA实验设计
• 2.2.9.4 EMSA操作步骤
• 3 实验结果
• 3.1 芯片数据及靶基因分析
• 3.2 TEAD1基因功能研究
• 3.2.1 组织及细胞总RNA提取结果
• 3.2.2 TEAD1基因的表达谱
• 3.2.2.1 小鼠TEAD1基因的组织表达谱
• 3.2.2.2 在C2C12细胞不同分化时期TEAD1基因的表达量
• 3.2.3 TEAD1基因对C2C12细胞增殖分化的影响
• 3.2.3.1 TEAD1基因在C2C12细胞中的真核表达结果
• 3.2.3.2 C2C12细胞分化标记基因的表达量结果
• 3.2.3.3 TEAD1基因的超表达对细胞增殖的影响
• 3.3 靶基因验证结果
• 3.3.1 Mrpl21,Ndufa6,Ccne1为TEAD1的靶基因
• 3.3.1.1 Mrpl21,Ndufa6,Ccne1基因启动子序列预测
• 3.3.1.2 靶基因表达量变化
• 3.3.1.3 靶基因的启动子活性检测
• 3.3.1.4 EMSA实验验证靶基因
• 3.3.2 Ankrd42基因间接受TEAD1调控
• 3.3.2.1 Ankrd42受TEAD1调控的证据
• 3.3.2.2 Ankrd42基因不直接受TEAD1调控
• 3.4 靶基因功能初步研究
• 3.4.1 靶基因在分化的C2C12细胞中的表达结果
• 3.4.2 Mrpl21基因的启动子分析
• 4 讨论
• 4.1 关于本研究的思路
• 4.2 实验结果的讨论
• 4.2.1 转录因子TEAD1对C2C12细胞增殖分化的影响分析
• 4.2.2 TEAD1如何实现对靶基因的调控
• 4.2.3 TEAD1对靶基因调控的意义
• 4.2.4 Mrpl21基因表达调控的深入理解
• 4.3 实验方法的讨论
• 4.3.1 关于基因启动子的生物信息学分析
• 4.3.2 超表达载体及启动子载体的构建
• 4.3.3 细胞周期检测实验的条件控制
• 4.3.4 成功的EMSA实验需要注意的事项
• 5 小结
• 5.1 本研究的主要结果与结论
• 5.2 本研究的创新点与特色
• 5.3 本研究不足之处与进一步工作的建议
• 参考文献
• 附录
• 攻研期间发表与接受的文章
• 致谢