论文摘要
鸭梨（Pyrus bretschneideri Rehd.cv.Yali）原产于河北,是古老的优质高产品种。鸭梨适应性较强,但抗黑星病能力弱。梨黑星病是鸭梨的主要病害,我国各鸭梨产区均有发生,常给梨树生产造成严重损失,已成为影响我国梨生产的主要限制因子。因此,选育抗梨黑星病的鸭梨优质变异新品种,是解决鸭梨发生黑星病最经济、最有效和最安全的方法。鸭梨距今栽培历史已有千年,在长期的栽培过程中,会自发的产生新变异类型。鸭梨Hc疑似普通鸭梨芽变新品种,鸭梨Hc母树和用其枝条进行嫁接的嫁接树,经田间数年观察,均表现对黑星病的高抗性。本研究以鸭梨Hc为材料,通过抗梨黑星病的田间鉴定,研究了鸭梨Hc抗黑星病的抗病类型,然后分别从叶片形态结构、生理生化指标及分子生物学等方面对其抗病机制进行系统研究。同时,对梨黑星菌的离体培养和鸭梨Hc茎段组织培养进行初步探索。主要研究结果如下:1.应用不同激素和不同维生素对梨黑星菌进行离体培养研究。结果表明,α-萘乙酸、2,4-D、激动素、6-BA、维生素B1和维生素C对梨黑星菌菌丝生长具有促进作用,其中α-萘乙酸促进作用最显著。α-萘乙酸最佳的添加浓度为10 mg/L。2.采用鸭梨Hc多年生树的冬剪休眠芽枝条,经室内水培催芽抽生嫩茎和当年萌发嫩茎为外植体,进行组织培养,结果表明,5月份中旬采集的嫩茎为适宜外植体。芽启动培养基为1/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.3mg/L。3.通过田间自然诱发法,对鸭梨Hc进行黑星病的抗性鉴定分析,结果表明,鸭梨Hc与对照（普通鸭梨）对黑星病的抗性存在显著差异。鸭梨Hc属于高抗黑星病类型,普通鸭梨为高感黑星病类型。4.对抗病鸭梨Hc与对照（普通鸭梨）不同成熟度叶片组织结构,包括叶片总厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、上下表皮厚度、组织紧密度和疏松度、蜡质含量,气孔密度、叶比重进行比较研究。研究表明:抗病鸭梨Hc叶片与普通鸭梨相比,具有表皮蜡质含量高、气孔密度低、栅栏组织排列紧密且厚、栅海比高及叶片细胞结构紧密的特点。这些叶片结构特点与鸭梨抗梨黑星病存在一定的相关性;叶比重与抗病性无相关性。5.对抗病鸭梨Hc与对照（普通鸭梨）不同成熟度健康叶片的生化物质含量,主要包括叶绿素、可溶性总糖、可溶性蛋白进行比较研究,发现鸭梨叶片自幼叶至成熟叶,抗病鸭梨Hc叶绿素含量、可溶性蛋白含量高于普通鸭梨,可溶性总糖含量低于普通鸭梨。6.应用正交设计的方法对影响鸭梨Hc ISSR-PCR反应的4个因素（模板DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶）进行5个水平的优化试验,PCR结果用DPS 7.55数据处理软件分析,确定出适合鸭梨Hc ISSR-PCR的最佳反应体系为:20μL反应体系中,1×Taq PCR Buffer[1.5mmol·L-1Mg2+]、模板DNA 60ng、0.4μmol·L-1引物、dNTPs浓度0.1mmol·L-1、Taq DNA聚合酶2U。反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性45 s,52℃（依据合成引物提供的Tm值确定）退火45 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保温。7.利用ISSR-PCR分子标记技术对鸭梨Hc进行品种鉴定。从100条供试ISSR引物中,经初步筛选,最终选定出10条引物用于品种鉴定分析。引物编号分别为:UBC807,UBC808,UBC810,UBC828,UBC829,UBC835,UBC841,UBC842,UBC850,UBC851。10条ISSR引物扩增条带总数为58条,条带大小在100-2000 bp之间,多态性条带仅为1条,占总条带数的1.72%。UBC810能较好地鉴别鸭梨Hc与对照（普通鸭梨）在分子水平上的遗传差异。鸭梨Hc在400bp大小位置扩增出一条明显的带,而普通鸭梨没有。8.将鸭梨Hc经引物UBC810扩增得到的一条特异片段进行回收、克隆测序,共获得6条不同序列。与已知EST序列比对分析表明,其中3条序列和苹果经过黑星菌侵染后的苗期叶片以及苹果种子、花和果实中的表达序列部分同源;另外3条为未知序列,目前正在进行相关序列克隆及其功能鉴定。