表皮干细胞的分离培养及蛋白组学研究

论文摘要

研究目的:完善表皮干细胞体外分离培养及鉴定的技术方法,建立皮肤角朊细胞与表皮干细胞总蛋白的双向电泳图谱,并初步分析二者表达蛋白质的差异,为进一步研究体外调控表皮干细胞的增殖分化提供线索。研究方法:采用酶消化法获得单个表皮细胞悬液,Ⅳ型胶原快速贴壁法分选表皮干细胞,以复合DMEM为培养基培养,免疫组化法检测CK19和P63,流式细胞仪检测β1整合素,CD71和细胞周期来鉴定目的细胞,通过细胞生长曲线观察其增殖能力;利用双向电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）建立皮肤角朊细胞与表皮干细胞的双向电泳图谱,Image Master 2D Elite 5.0软件分析两种细胞的差异表达蛋白点。结果:Ⅳ型胶原筛选细胞在复合DMEM培养基中生长良好,CK19和P63阳性表达,β1整合（CD29）表达率为98.57%,CD71表达率为9.05%,94.99%细胞处于增殖期,细胞呈现指数增长,以上表明分选细胞是表皮干细胞;两种细胞的2-DE蛋白表达谱具有良好的重复性和可比性,皮肤角朊细胞与表皮干细胞的电泳图谱平均蛋白质点数分别为982±18和930±15,匹配点数为850±13和798±11,匹配率是86.56%和85.81%,两种细胞蛋白质间匹配点数是886±8,配率是76.98%。找到差异蛋白点11个,其中只在表皮干细胞中表达或高表达的有8个,只在皮肤角朊细胞中表达或高表达的有3个。结论:本实验采用多种方法证实贴壁细胞为表皮干细胞,利用双向电泳法得到了分辨率较高且重复性好的皮肤角朊细胞与表皮干细胞蛋白质组图谱,二者存在一定的差异,这对获取组织工程皮肤的种子细胞及探索体外调控表皮干细胞的增殖分化机制具有重要意义。

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前言

1.表皮干细胞的概念及生物学特性

2.表皮干细胞的定位

3.表皮干细胞的标志物

4.表皮干细胞的分离方法

5.表皮干细胞增殖分化的调控机制

6.表皮干细胞的应用

主要材料、试剂和仪器

1.实验动物

2.主要仪器

3.主要试剂

4.主要培养液及试剂的配制

实验方法

1.表皮干细胞的获取与扩增

2.表皮干细胞的鉴定及形态学观察

3.角朊细胞与表皮干细胞蛋白组学

4.表皮干细胞与I型胶原材料

实验结果

1.表皮干细胞的体外分离,培养与扩增

2.表皮干细胞鉴定

3.细胞周期结果

4.细胞生长曲线

5.双向电泳图谱

6.表皮干细胞与I型胶原材料接合良好

讨论

1.表皮干细胞的分离培养及鉴定

2.角朊细胞与表皮干细胞双向电泳图谱的建立及分析

3.组织工程皮肤

4.综合评价

5.展望

结论

参考文献

附图

缩略词表

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致谢

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