利用酵母双杂交技术筛选p12CDK2AP1新的相互作用蛋白Nbp及生物信息学分析

论文摘要

癌是严重威胁人类健康,甚至致人死亡的恶性疾病,其发病率逐年增高,并有年轻化的趋势,一直以来都是医学领域中研究的重要课题之一。口腔癌的发生率高,在世界范围内口腔癌的发生率排在所有癌的第六位,且由于发病部位特殊,严重影响病人的外形和功能,甚至威胁患者生命。近年来在分子水平上研究癌的发生机制及其与癌基因、抑癌基因的相互作用关系已成为研究癌的发病机制及基因治疗的主要方向之一。目前的研究成果已经指出,癌的发生与癌基因的表达和抑癌基因的失表达密切相关。CDK2AP1（cyclin dependent kinase 2 associating protein 1）基因就是一个与口腔癌发病有关的候选抑癌基因。CDK2AP1基因原称DOC-1基因（deleted in oral cancer-1,口腔癌缺失-1）,于1995年被Todd等人在仓鼠口腔癌模型中发现、分离并证实的一个候选抑癌基因,p12CDK2AP1蛋白是其编码蛋白,具有抑制癌细胞生长的作用。人类CDK2AP1基因位于染色体12q24,编码115个氨基酸,其表达蛋白p12CDK2AP1分子量为12.4kDa。在利用仓鼠模型对CDK2AP1的研究中发现,CDK2AP1可以诱导仓鼠口腔中恶性角化细胞凋亡。其表达蛋白p12CDK2AP1通过下调CDK2（细胞周期依赖性蛋白激酶2）的活性和表达水平进而减弱对Rb基因的抑制,起到抑制癌细胞生长的作用。在鳞状细胞癌细胞中异位表达P12CDK2AP1蛋白后,其与CDK2和DNA-polymeraseα（DNA聚合酶α）结合,抑制了这两种酶的活性,使细胞的恶性表型发生转变。目前,关于p12CDK2AP1蛋白在人口腔鳞癌中的表达显著降低甚至缺失的机理尚不完全清楚,与其相互作用蛋白及其发挥作用的蛋白网络尚不明确。本研究采用酵母双杂交技术在正常人肝cDNA文库中筛选与p12CDK2AP1蛋白相互作用的蛋白质,从而发现与p12CDK2AP1蛋白相互作用的相关蛋白,利用生物信息学手段分析预测互作蛋白的性质类型,为进一步阐明CDK2AP1基因作用的机理,研究CDK2AP1的功能,揭示p12CDK2AP1蛋白的作用网络奠定基础。实验目的:本课题研究的目的是通过酵母双杂交技术在正常人肝cDNA文库中筛选与p12CDK2AP1蛋白相互作用的蛋白质,从而进一步研究p12CDK2AP1蛋白在口腔癌缺失中的相关蛋白及作用网络。利用生物信息学手段分析互作蛋白的性质类型。通过研究p12CDK2AP1蛋白与互作蛋白的相互作用关系,为进一步阐明CDK2AP1基因作用的机理奠定基础。实验方法:1、优化已有的酵母双杂交筛选工作体系,使其进一步高效准确,为后续筛选提供有利条件。2、利用分子克隆的方法重组针对p12CDK2AP1蛋白的酵母双杂交诱饵质粒,并验证其实用性。同时扩增正常人肝cDNA文库,为下一步进行p12CDK2AP1蛋白的相互作用蛋白筛选奠定基础。3、利用酵母双杂交技术在正常人肝cDNA文库中筛选与p12CDK2AP1蛋白相互作用的蛋白。4、使用生物信息学技术相关数据库和软件预测和分析互作蛋白的信息。包括互作蛋白的物种分类、基因组定位、互作蛋白的理化性质、跨膜特性、亚细胞定位、信号肽表达、二级结构、可能的功能基序和功能位点以及可能的同源蛋白之间的同源性比对。实验结果:利用酵母双杂交的方法,在正常人肝组织cDNA文库中发现了一个与p12CDK2AP1蛋白有相互作用的新的蛋白质（GENE ID LOC93622、hypothetical protein BC006130）,长度为119个氨基酸,暂时命名为Nbp（New binding protein,新结合蛋白）。通过酵母双杂交回转实验及NCBI blast,排除实验结果假阳性、酵母蛋白干扰、去除非编码区,确定该段cDNA序列为人类DNA,DNA序列符合率100%,染色体定位于人类4号染色体。发现其染色体定位、核酸序列、氨基酸序列MORF4蛋白（mortality factor 4）相似,可能与MRG（Mortality Related Genes）蛋白家族有一定的关系。利用生物信息学的方法,分析预测了Nbp蛋白的理化性质、二级结构、亚细胞定位、信号肽分泌以及其氨基酸序列中存在的可能的功能位点。实验结论:利用酵母双杂交技术成功筛选出了一个与p12CDK2AP1蛋白相互作用的新的蛋白质Nbp,通过生物信息学方法预测了Nbp蛋白的理化性质、二级结构、亚细胞定位、信号肽分泌以及其氨基酸序列中存在的可能的功能位点。利用分子克隆技术成功重组了Nbp蛋白的真核表达质粒,为继续深入研究CDKAP1基因、p12CDK2AP1蛋白及其互作蛋白的功能和作用网络奠定了基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• CDK2AP1的相互作用蛋白质'>第一部分：利用酵母双杂交技术在正常人肝cDNA 文库中筛选p12^CDK2AP1的相互作用蛋白质
• 实验一：优化酵母双杂交筛选体系
• 1 实验目的
• 2. 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 实验二：重组酵母双杂交诱饵质粒并扩增cDNA 初始文库
• 1 实验目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• CDK2AP1的相互作用蛋白质'>实验三：利用酵母双杂交技术在正常人肝cDNA 文库中筛选p12^CDK2AP1的相互作用蛋白质
• 1 实验目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 讨论
• 第二部分 Nbp 生物信息学相关分析
• 实验四：利用生物信息学技术分析Nbp 蛋白的结构和功能
• 1 实验目的
• 2 实验中所使用的生物信息软件和生物信息数据库
• 3 预测方法
• 4 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢