嗜水气单胞菌J-1株luxS基因缺失株的构建及特性分析

论文摘要

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila, Ah）是重要的水生病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,同时还是重要的人畜共患病病原菌。该菌的致病性与其产生的毒力因子密切相关,已知毒力因子有胞外酶、溶血素、肠毒素以及粘附素如菌毛和表面蛋白S层等。这些毒力因子相互协同作用于机体,发挥毒性作用。此过程受到严格的调控,群体感应系统参与此调控过程。群体感应（Quorum Sensing, QS）即细菌在生长过程中通过一定的信号分子来传递信息,使细胞能感知周围环境中自己同类的数量,并据此调节自身基因的表达,产生特定的行为。群体感应细菌产生、释放、响应的信号分子命名为自体诱导物（Autoinducer, AI）.本试验根据已发表的嗜水气单胞菌QS相关基因序列设计引物,以J-1株基因组为模板,PCR扩增分别得到AI-1合成酶基因ahyI;AI-2合成酶基因luxS、转录结合蛋白ahyR基因核苷酸序列。测序分析发现,扩增出的3段基因与已测出全基因组的嗜水气单胞菌ATCC7966的同源性较高。用根瘤农杆菌JZA1(Agrobacterium tumefaciens脸测AI-1；哈维氏弧菌BB170（Vibrio harveyi）险测AI-2,结果均能测出信号,说明嗜水气单胞菌可能存在双组分QS信号传导系统。AI-1对嗜水气单胞菌毒力因子的调控已有报道,而luxS为嗜水气单胞菌ATCC7966株全基因组测序发现的S一核糖高半胱氨酸（SRH）裂解酶同源基因,该酶在其他细菌中被证实参与催化合成AI-2。对于luxS基因在嗜水气单胞菌中的功能,以及它在QS中扮演何种角色还知之甚少。本试验构建了luxS基因缺失株,为下一步分析奠定基础。根据ATCC7966的全基因组序列设计合成两对引物,分别扩出luxS基因上下游1000bp左右的序列。选择合适的酶切位点,在上下游片段中间插入氯霉素抗性基因,构建缺失luxS的自杀性质粒pHM5 （luxS）。将该质粒转入E.coli SM10,接合法将质粒转入嗜水气单胞菌J-1株,在含有氯霉素、头孢唑啉的培养基上筛选单交换插入株。PCR验证后单交换菌株接入无NaCl、含20%蔗糖的LB液体培养基中,倍比稀释后涂浓度20%蔗糖的LB平板,PCR鉴定双交换缺失株。luxS基因缺失后发现,细菌生长较野生株慢。AI-1产生第一个波峰提前,第二个波峰升高,说明luxS缺失也会影响信号分子1的合成,这暗示了QS系统1和QS系统2协同调控的功能。缺失luxS后细菌几乎不产生AI-2,这确证了LuxS的AI-2合成酶功能。不管是缺失株还是野生株,在血平板和脱脂奶平板上均能产生透明圈,说明缺失株产生溶血素和胞外蛋白酶的能力没有丢失。随后的RT-PCR分析发现,与野生株相比,缺失株在对数生长期和稳定期溶血素基因表达没有显著变化,而丝氨酸蛋白酶基因在对数生长期表达较高,在稳定期显著降低。这与QS系统1调控胞外蛋白酶方式一致。全菌蛋白SDS-PAGE比较发现,缺失株中一个明显的蛋白条带丢失；而上清蛋白SDS-PAGE没有发现蛋白条带明显的改变。小鼠攻毒试验表明,缺失株与野生株对小鼠的半数致死量相等,致病性上的差别仅体现在小鼠死亡时间上,缺失株在8h死亡率低于野生株,但16时后死亡率则相等。该研究为进一步探讨luxS基因的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇文献综述
• 第一章 嗜水气单胞菌致病机理研究进展
• 1 毒力因子
• 2 分泌系统与致病性
• 3 致病性调控
• 4 展望
• 参考文献
• 第二章 群体感应系统2研究进展
• 1 细菌的QS系统1
• 2 细菌的QS系统2
• 3 QS系统调控Ⅲ型分泌系统
• 4 AI-2的分布与信号传导通路
• 5 luxS基因的缺失对于细菌的影响
• 6 AI-2,一种信号分子还是细菌代谢产物?
• 参考文献
• 下篇 试验研究
• 第三章 嗜水气单胞菌J-1株QS系统基因克隆分析与AI信号分子检测
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 嗜水气单胞菌J-1株luxS基因缺失株的构建与鉴定
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 嗜水气单胞菌J-1株luxS基因缺失株特性分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢