鸭白细胞抗菌肽的初步鉴定及粗提物对小鼠免疫功能的影响

论文摘要

本试验以樱桃谷鸭为研究对象,对其血液白细胞中抗菌肽成分进行了提取和分离,并初步研究了其对小鼠免疫功能的影响。本试验共分为两个系列。系列Ⅰ鸭白细胞抗菌肽的提取、分离与初步鉴定采集新鲜樱桃谷鸭血液,用0.83%氯化铵反复裂解红细胞,得到白细胞,将收集到的白细胞,通过超声波充分破碎、乙酸浸提、低温高速离心、旋转蒸发除去乙酸、冷冻干燥等方法,得到鸭白细胞抗菌肽粗提物。使用微量琼脂糖弥散法测定其抑菌活性,结果表明,在樱桃谷鸭血液白细胞中存在天然抗菌物质,并表现出对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）,革兰氏阴性菌（大肠杆菌）和白色念珠菌（真菌）较强的抑制作用。将得到的粗提物,经过CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）纯化后,收集各组分,并使用微量琼脂糖弥散法测定各组分的抑菌活性。抑菌试验显示,抗菌物质是阳离子性质,对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）的抑制作用稍强于对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和白色念珠菌（真菌）的抑制作用。而经过RP-HPLC分离纯化后显示,提取到的抗菌肽有较强的抑制革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和白色念珠菌（真菌）生长的作用,而对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）的抑制作用较弱,使用MALDI-TOF-MS法对经RP-HPLC纯化后收集的几个活性组分进行分子量的测定,其结果分别为5351Da、5653 Da、5607 Da、5464 Da和4325 Da。系列Ⅱ鸭白细胞粗提物对小鼠免疫功能的影响采取上述方法制备鸭血液白细胞粗提物。粗提物对小鼠免疫功能影响的动物试验分A、B两组。A、B组各分为五组:对照组、蛋白对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。每组12只小鼠。每日定时灌胃,A组灌胃14天后采样,测定小鼠免疫器官指数、E玫瑰花环形成率、碳粒廓清指数。B组灌胃14天或21天后采样,测定小鼠免疫器官指数、外周血T细胞亚群。测定结果表明:白细胞粗提物灌胃不同的剂量,与对照处理相比,高剂量组的免疫器官指数差异显著（P＜0.05）,巨噬细胞吞噬指数差异极显著（P＜0.01）;各剂量组的E玫瑰花环形成率均有极显著差异（P＜0.01）;中、高剂量组的T细胞亚群CD3+、CD4+和CD4+/CD8+差异极显著（P＜0.01）,初步说明白细胞粗提物能提高小鼠的机体免疫力。白细胞粗提物灌胃14天和21天后,小鼠的免疫器官指数、巨噬细胞吞噬指数、E玫瑰花环形成率和T细胞亚群CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均有显著提高,但灌胃14天的各组与灌胃21天的各组相比,差异不显著（P＞0.05）。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 抗菌肽的分布及理化性质
• 1.2 抗菌肽的分类
• 1.3 禽类β-防御素
• 1.3.1 禽类β-defensins的分类
• 1.3.2 禽类β-defensins的分子结构
• 1.3.3 禽类β-defensins的抗菌作用及机制
• 1.3.4 禽类β-defensins的研究现状
• 1.4 抗菌肽在宿主免疫系统中的作用
• 1.5 抗菌肽的应用研究
• 1.5.1 抗菌肽的药用开发与应用
• 1.5.2 抗菌肽在动植物转基因工程中的应用
• 1.5.3 抗菌肽在畜牧生产上的应用
• 1.5.4 抗菌肽在食品和化妆品领域中的应用
• 2 引言
• 3 系列Ⅰ 鸭白细胞抗菌肽的提取、分离与初步鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 试验动物
• 3.1.1.2 供试菌种
• 3.1.1.3 主要仪器
• 3.1.1.4 主要试剂及配制
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 鸭血液白细胞的获取
• 3.1.2.2 白细胞抗菌肽粗提物的提取
• 3.1.2.3 微量琼脂糖弥散法测定鸭白细胞抗菌肽的抑菌活性
• 3.1.2.4 阳离子交换层析
• 3.1.2.5 蛋白质含量测定
• 3.1.2.6 反相高效色谱法（RP-HPLC）纯化抗菌肽
• 3.1.2.7 抗菌肽分子量的测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 鸭白细胞抗菌肽的获取
• 3.2.2 抗菌肽粗提物抑菌作用的测定结果
• 3.2.3 离子交换层析结果
• 3.2.4 抗菌肽离子交换层析产物抑菌作用的测定结果
• 3.2.5 抗菌肽离子交换层析活性峰RP-HPLC分离结果
• 3.2.6 抗菌肽离子交换层析阳性组分经RP-HPLC分离后活性峰分子量的测定结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 鸭白细胞抗菌肽抑菌活性的比较
• 3.3.2 鸭白细胞抗菌肽的提取分离
• 3.3.3 鸭白细胞抗菌肽的初步鉴定
• 3.4 小结
• 4 系列Ⅱ 鸭白细胞粗提物对小鼠免疫功能的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 试验动物及分组处理
• 4.1.1.2 试验设计
• 4.1.1.3 试验环境
• 4.1.1.4 主要仪器和设备
• 4.1.1.5 主要试剂及配制
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.2.1 免疫器官指数的测定
• 4.1.2.2 E玫瑰花环形成率的测定
• 4.1.2.3 碳粒廓清的测定
• 4.1.2.4 外周血T淋巴细胞亚群的测定
• 4.1.3 数据分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 白细胞粗提物对小鼠免疫器官指数的影响
• 4.2.2 白细胞粗提物对小鼠E玫瑰花环形成率的影响
• 4.2.3 白细胞粗提物对小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响
• 4.2.4 白细胞粗提物对小鼠T细胞亚群的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 白细胞粗提物对小鼠非特异性免疫水平的影响
• 4.3.2 白细胞粗提物对小鼠特异性免疫水平的影响
• 4.4 小结
• 参考文献
• ABSTRACT
• 附图