论文摘要
本研究探讨了牛活体采卵（OPU）和分离精子体外受精（IVF）的方法,以提高牛OPU-IVF生产胚胎的效率。论文分为两部分:第一部分为文献综述,包括第一和第二章;第二部分是试验研究,包括第三、第四和第五章。第三章主要探讨优势卵泡、促性腺激素和用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶解促卵泡素（FSH）一次肌肉注射对牛OPU效果的影响,以确立OPU供体牛的外源激素处理方法。试验1将8头供体奶牛随机分为4组,每组2头,分别按是否去除优势卵泡和是否注射FSH处理供体牛,FSH处理方法是连续注射2d,每天2次,处理后72h应用B型超声波导引采卵,试验重复10次。试验2将去除优势卵泡的6头供体牛随机分为3组,每组2头,分别采用孕马血清促性腺激素（PMSG）、FSH和对照处理供体牛,采卵方法同试验1。试验3采用4×4拉丁方设计,将去优势卵泡的8头供体牛随机分为4组,每组2头,分别按15%PVP、30%PVP、生理盐水（对照组）溶解FSH一次肌注和FSH分次注射（常规组）处理供体奶牛,采卵方法同上,并采血测定供体牛注射FSH后不同时间的血清FSH含量变化,同时观察停止采卵后供体牛的繁殖性能恢复情况。结果显示:（1）注射FSH前去除优势卵泡可显著提高可采卵泡数、回收卵母细胞数和可用卵母细胞数（p＜0.05）,但不注射FSH时去除优势卵泡与否效果无显著差异。（2）与注射PMSG和对照组比较,采卵前72h注射FSH可显著提高可采卵泡数和可用卵母细胞数（p＜0.05）,但注射PMSG与否差异不显著（p＞0.05）。（3）30%PVP溶解FSH一次肌注采卵效果与常规组无显著差异（p＞0.05）,但OPU效果显著优于15%PVP组和对照组（p＜0.05）;而15%PVP组与对照组比较差异不显著（p＞0.05）;30%PVP组和常规组体内血清FSH浓度变化趋势相似,可延长体内维持一定浓度FSH的时间;而15%PVP组和对照组维持时间较短。（4）OPU将对牛卵巢造成一定损伤,但停止采卵2-3月后供体牛均能恢复正常发情,配种后其受胎率（76.9%）与未活采奶牛受胎率（78.7%）比较无显著差异。第四章主要探讨用外源激素（FSH、PMSG）处理供体牛后活体采集的卵母细胞、屠宰牛卵巢采集的卵母细胞及其经体外不同保存时间后对IVF效果影响。由于牛分离精子来源有限,故先选用未分离精子进行IVF试验,为第五章用分离精子体外受精提供技术基础。本章包括三个试验,试验1分别将外源激素和无激素（对照组）处理供体牛后采集的卵母细胞进行IVF,记录各组受精后48h卵裂数,7-8d囊胚数,并将3枚第7d生产的OPU-IVF囊胚分别移植给3头人工授精后受体奶牛。试验2、3采集来源于屠宰黄牛卵巢的卵母细胞进行IVF,以比较离体卵巢抽取卵母细胞和活体采集卵母细胞的IVF生产胚胎效果,并比较卵母细胞经不同时间体外保存后对IVF效果影响。结果显示:（1）外源激素处理供体奶牛后活体采集卵母细胞,其IVF的卵裂率和囊胚率分别是65.95%、25.74%,与对照组分别为66.67%、26.67%比较无显著差异（p＞0.05）,将胚胎移植给3头经人工受精后的受体牛,结果有1头产双胎,其中1头犊牛来自OPU-IVF生产的胚胎。（2）活体采集卵母细胞的IVF卵裂率、囊胚率和Ⅰ、Ⅱ级囊胚率分别是66.07%、25.89%、16.52%,与离体卵巢采卵IVF卵裂率（70.26%）、囊胚率（30.53%）和Ⅰ、Ⅱ级囊胚率（18.42%）比较无显著差异（p＞0.05）。（3）卵母细胞体外保存3h后,其IVF卵裂率和囊胚率与对照组比较无显著差异（p＞0.05）,但体外保存6h、9h后,其IVF的卵裂率、囊胚率显著降低（p＜0.05）。第五章在牛未分离精子IVF的基础上,进行分离精子IVF试验。通过探讨旋涡震荡法或微管吹打法除去受精卵卵丘细胞、两种分离精子IVF前处理方法、早期胚胎培养液添加胰岛素和活体采集卵母细胞等对分离精子IVF效果影响,以提高牛分离精子IVF效率。试验1-4采集来源于屠宰牛卵巢的卵母细胞进行体外成熟培养,随后分别与洗涤法或Percoll法处理的牛分离精子、未分离精子进行IVF,受精后6-8h将假定受精卵分别用震荡法或吹打法除去卵丘细胞,然后移入添加胰岛素的培养液与颗粒细胞单层共培养,记录各组受精后48h卵裂数,7-8d囊胚数,并采用PCR技术测定所产胚胎的性别准确率。试验5将活体采集卵母细胞与分离的X精子进行IVF,并将所产第7-8d的优质胚胎冷冻保存,以观察其解冻后复苏率,以及将冻胚移植给5头经同期发情处理的受体牛妊娠效果。结果显示:（1）采用震荡法或吹打法除去常规精子IVF的受精卵卵丘细胞,其卵裂率、囊胚率无显著差异（p＞0.05）,但采用震荡法除去分离精子IVF受精卵颗粒细胞,培养后IVF的卵裂率、囊胚率显著高于吹打法（p＜0.05）。（2）早期胚胎培养液添加5μg/mL、10μg/mL的胰岛素与对照组比较囊胚率和囊胚细胞数显著增加（P＜0.05）,但添加5μg/mL和10μg/mL胰岛素组间的囊胚率和囊胚细胞数无显著差异（p＞0.05）。（3）采用洗涤法制备分离精子用于IVF,虽精子活力和囊胚率与Percoll法比较无显著差异,但其活精子数显著提高。（4）用X精子和Y精子IVF后的卵裂率、囊胚率无显著差异（p＞0.05）,但均显著低于未分离精子的IVF结果（p＜0.05）。经PCR检测X、Y精子受精所得囊胚的性别准确率分别是90.63%和86.67%。（5）性控胚胎可冷冻保存,其冷冻后囊胚复苏率和孵化率与常规胚胎无显著差异（p＞0.05）。（6）活体采集的卵母细胞与X精子IVF的卵裂率和囊胚率分别是46.15%、13.85%,且移植受体牛可妊娠。结论:（1）FSH处理前去除优势卵泡可显著提高采卵效率;（2）注射FSH提高活体采卵效果显著优于PMSG;（3）30%PVP溶解FSH一次肌注供体牛,可延长FSH在体内存留时间,提高活体采卵效果;（4）OPU对供体牛繁殖性能无显著影响;（5）可用外源激素处理供体奶牛OPU-IVF生产胚胎,并经胚胎移植给人工授精后的受体牛产双犊,且生产胚胎效果与屠宰牛卵巢抽卵相接近;（6）活体采集卵母细胞应在3h内送实验室培养;（7）旋涡震荡法除去分离精子IVF的受精卵卵丘细胞,可显著提高其卵裂率和囊胚率;（8）早期胚胎培养液添加5μg/mL胰岛素能促进性控胚胎的发育;（9）洗涤法处理分离精子能显著提高分离精子利用效率,且方便、经济;（10）X、Y精子IVF效果无显著差异,X和Y精子IVF后所得胚胎的性别准确率分别为90.63%和86.67%;（11）初步建立牛了分离精子的OPU-IVF技术体系,可将OPU的卵母细胞与X或Y精子进行IVF生产性控胚胎,但其囊胚率还有待提高。