论文摘要
背景与目的心脏瓣膜病是我国的常见病之一，严重危害着国人健康，瓣膜置换术是外科治疗严重心脏瓣膜疾病的主要方法。目前临床上应用的人工心脏瓣膜主要有机械瓣和生物瓣两种。机械瓣置换后须终生服用抗凝药，因抗凝不当而造成的出血、血栓形成及栓塞是影响患者长期存活及生活质量的重要因素；生物瓣置换后，尽管无需长期抗凝治疗，但由于瓣膜缺乏生命活力，术后易发生生物瓣退行性变、钙化而导致瓣膜衰败，部分患者需二次手术置换。此外，这些人工心脏瓣膜均不具有生长能力，尤其不适用于儿童或年轻心脏瓣膜病患者。随着组织工程学科的发展，组织工程心脏瓣膜（Tissue Engineering HeartValve，TEHV）被认为是根本解决心脏瓣膜置换术后并发症的革命性产品，自提出以来一直被人们寄予厚望。TEHV是按照组织工程学方法，将体外培养、扩增的自体活细胞种植在可降解材料构建的瓣膜支架上，使自体活细胞在支架上生长并产生细胞外基质，逐渐形成具有活性的瓣膜组织，培养出一种无免疫源性、无需抗凝、耐久性强的新一代生物心脏瓣膜。同时，由于它具有生物活性，可在体内生长、发育，并可抵御感染入侵，尤其适用于儿童或感染性心内膜炎患者。自1995年Shinoka首先在体外培养TEHV并于羊体内进行动物实验以来，国内外已进行了大量的研究，并已在种子细胞的选择、瓣膜支架材料的获取等方面取得一定的进展。但是在细胞种植的方法、条件、培养环境等方面尚未找到理想的办法，如何将种子细胞简便、牢固地种植于瓣膜支架材料上已成为目前噬待解决的关键问题之一。本实验就是在总结了前人细胞种植时单独种植一种细胞细胞容易脱落的失败经验上，并依据正常人体心脏瓣膜结构是由两层不同细胞构成的客观事实，提出了联合种植肌成纤维细胞和内皮细胞构建TEHV的设想。尝试在瓣膜支架材料上分层依次联合种植肌成纤维细胞和内皮细胞，通过光镜、电镜及免疫组织化学染色等方法观察其生长特点，探索构建结构稳定、功能完善的TEHV的最佳细胞种植方法。材料与方法1、无菌条件下抽取人骨髓5ml，利用密度梯度离心法分离出骨髓间充质干细胞（BMSCs），将细胞分成两组：一组在DMEM-LG培养液中培养、扩增；另一组在含有血管内皮细胞生长因子（VEGF）的M199培养液中诱导培养、扩增，使其定向分化为内皮细胞（ECs）。并进行BMSCs和ECs的相关鉴定。2、瓣膜支架材料采用猪主动脉瓣膜，经低浓度胰蛋白酶+EDTA+DCA+核酸酶的组合方法脱细胞后缝制在人工瓣环上建成完整瓣膜支架。并应用扫描电镜观察脱细胞效果。3、细胞种植分3组同时培养做对比研究：联合种植肌成纤维细胞和内皮细胞作为实验组，共培养4周，单独种植其中一种细胞作为对照组，各培养2周。取样分别行HE染色、免疫组化染色、扫描电镜观察等对实验组和对照组瓣膜进行结构及功能鉴定。结果1、研究证实，BMSCs的自然分化方向为肌成纤维细胞，而在加入VEGF等诱导因子的培养液中培养可以定向分化为内皮细胞。2、猪主动脉瓣膜结构与人体瓣膜相似，经胰蛋白酶、脱氧胆酸和核酸酶处理后，可发现瓣膜表面细胞去除完全，纤维支架结构保存完整。3、实验组与对照组相比较，瓣膜支架表面有复层细胞生长，最外面有单层内皮细胞覆盖，细胞间连接紧密，在流体环境中培养，细胞表现出一定的方向性。结论联合种植肌成纤维细胞和内皮细胞构建的TEHV，细胞数量多，排列紧密，黏附牢固，无论在结构还是功能上都更接近于人体的瓣膜，更符合临床的应用要求。与单独种植一种细胞相比较，分层依次联合种植两种细胞是一种先进的、有效的细胞种植方法。
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