人类胚胎干细胞体外诱导分化为神经上皮细胞及多巴胺能神经元的初步研究

论文摘要

第一部分人类胚胎干细胞向神经上皮细胞分化的两种诱导体系的比较研究目的：1．比较两种诱导体系下，hESCs向神经上皮细胞诱导分化的效率，以建立高效的诱导培养体系；2．探讨在两种诱导体系下，hESCs向神经分化过程是否都符合体内早期神经发育的规律。方法：hESCs在人源性饲养层培养体系下传代培养。A组在饲养层细胞上直接诱导，B组经类似EB的悬浮阶段。16天后对两个诱导体系在d0、d6、d10、d16的细胞行RT-PCR检测多能性基因，早期神经发育相关基因，内、中胚层基因，区域化基因的表达情况，及免疫细胞化学检测hESCs多能性标记和神经相关标记的表达情况。结果：1．两种诱导体系下，d10和d16均能够产生大量Nestin和Musashi染色阳性的神经上皮细胞；2．Pax6和Sox1阳性细胞计数结果显示A组的神经诱导效率高于B组；3．两组细胞d10均为典型Pax6+Sox1-的Rosette结构，d16均为Pax6+Sox1+的神经管样结构；4．两组细胞基因表达趋势相似，全能性基因的表达下调，神经相关基因表达上调；5．A组细胞表达较高的前脑标记，B组细胞表达较高的中后脑标记。第二部分神经上皮细胞诱导为多巴胺能神经元的研究目的：1．建立神经上皮细胞分化为DA能神经元的诱导体系，为帕金森病的替代治疗提供细胞来源；2．比较不同阶段的上皮细胞诱导分化为DA能神经元的差异。方法：早期处理组和晚期处理组分别以d10天和d16的神经上皮细胞为材料，用含100ng／ml FGF8和200 ng／ml SHH的诱导培养基，培养至第22天，对照组采用不含SHH和FGF8的培养基，RT-PCR检测中脑多巴胺能神经元相关基因En1和Nkx6.1的表达，免疫细胞化学检测中脑多巴胺能神经元特异性标记TH的表达。结果：1．d22时早期处理组细胞En1和Nkx6.1的表达明显强于晚期处理组和空白对照组；2．早期处理组有大量TH+克隆，晚期处理组仅有少数TH+克隆。第三部分帕金森大鼠模型的构建目的：构建稳定、可靠的帕金森大鼠模型，为进行细胞移植治疗提供动物模型。方法：在大鼠脑立体定位仪上用4ug／ul 6-羟基多巴胺（6-OHDA）注射至成年SD大鼠右侧内侧前脑束和黑质致密部各2ul，然后应用阿朴吗啡（APO）诱发旋转，进行行为学观察，并灌注、切片行酪氨酸经化酶（TH）的免疫组织化学检测。结果：1．PD模型鼠出现典型的旋转行为，10只中有5只旋转速度超过210圈／30分钟，在检测的连续4周中，旋转速度未见下降。2．TH免疫组化染色见损毁侧黑质致密部的TH阳性细胞大部分丢失。结论：1．建立了人源性的hESCs向神经上皮细胞诱导分化体系，经比较发现，直接诱导法比经EB诱导法具有更高的诱导效率；2．体外进行神经诱导的过程都符合体内的早期神经发育过程；3．诱导第10天的神经上皮细胞命运还未限定，是进一步诱导分化的起始作用时间点；4．在第10天的神经上皮细胞中加入FGF8和SHH能够诱导获得中脑DA能神经元；5．采用单侧双位点注射6-OHDA能获得稳定、可靠的偏侧PD大鼠模型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写注解
• 技术路线
• 前言
• 第一部分 hESCs向神经上皮细胞诱导分化的研究
• 1 材料与试剂
• 1.1 细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 hESCs的分化
• 2.3 免疫组化
• 2.4 RNA的抽提、纯化
• 2.5 RT-PCR检测
• 3 结果
• 3.1 hESCs的培养
• 3.2 hESCs的分化
• 3.3 免疫组化及计数结果
• 3.4 RT-PCR检测基因表达结果
• 4.讨论
• 第二部分 诱导神经上皮细胞向多巴胺能神经元分化的研究
• 1.材料和试剂
• 1.1 细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 2.方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 免疫组化
• 2.3 RNA的抽提
• 2.4 RT-PCR检测
• 3.结果
• 3.1 神经上皮细胞的分化
• 3.2 RT-PCR检测基因表达
• 3.3 免疫组化
• 4.讨论
• 第三部分 帕金森大鼠模型的构建
• 1.材料和试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 2.方法
• 2.1 实验分组
• 2.2 6-OHDA注射
• 2.3 行为学检测
• 2.4 组织固定及切片
• 2.5 TH免疫组织化学染色
• 3.结果
• 3.1 动物行为学检测及评估
• 3.2 TH免疫组织化学染色结果
• 4 讨论
• 5.结论
• 总结
• 附图
• 参考文献
• 综述
• 致谢