疏水微孔板诱导CRP变构形成兼具pCRP和mCRP双重抗原性的生物活性异构体

论文摘要

大量证据表明CRP存在两种异构体,五聚体CRP （pCRP）和单体CRP（mCRP）。研究发现这两种异构体在炎症过程中均担任重要角色并参与心血管疾病的病生理过程。目前,越来越多的研究开始将pCRP功能的发挥与可能存在的具有独立特性的CRP异构体（不仅是mCRP）联系起来,并认为pCRP的变构在其相关功能中起重要调节作用。本文探讨了聚氯乙烯板这一强疏水界面所诱导的pCRP的变构行为,通过一系列工作鉴定出了一种新的、兼具pCRP和mCRP的双重抗原性的变构分子,同时对此变构分子的性质和功能作了初步探究,证实其可与pCRP发生高亲力、Ca依赖性结合,此结合与CRP的C端八肽（aa199-207）、PC识别位点和8D8抗原表位相关；并可激活补体,刺激单核巨噬细胞效应。通过对此疏水界面所诱导的pCRP变构分子的性质和功能的鉴定,为机体内pCRP与凋亡或受损细胞相互作用进而参与炎症过程提供了一种可能方式。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 蛋白
• 2.1.1 人CRP纯化
• 2.1.2 重组人mCRP的制备与纯化
• 2.1.3 变性mCRP的制备
• 2.1.4 CRP与特异性配体结合
• 2.1.5 CRP/mCRP抗原性检测
• 2.1.6 分子筛排阻层析
• 2.1.7 1/20SDS-PAGE电泳
• 2.1.8 内毒素检测与去除
• 2.1.9 叠氮化钠的去除
• 2.1.10 CRP的biotin标记
• 2.1.11 CRP的FITC标记
• 2.1.12 蛋白总量测定方法
• 2.2 抗体及其他材
• 2.2.1 CRP/mCRP/C1q/C3d单抗
• 2.2.2 热聚集IgG的制备
• 2.2.3 CRP肽段、Latex Bead、PMA、多粘菌素B等
• 2.3 生化实验
• 2.3.1 蛋白直接包被ELISA板各抗原性检测
• 2.3.2 包被CRP/mCRP与biotin-pCRP的结合
• 2.3.3 biotin-CRP与FITC-CRP结合
• 2.3.4 PC/单抗/肽段/mCRP与biotin-CRP的竞争结合
• 2.4 补体沉积
• 2.4.1 C1q沉积
• 2.4.2 C3d沉积
• 2.5 细胞系和原代细胞
• 2.5.1 U937/THP-1的培养
• 2.5.2 U937/THP-1的诱导分化
• 2.5.3 小鼠腹腔原代巨噬细胞的获得及培养
• 2.6 蛋白与细胞相互作用
• 2.6.1 蛋白包被珠子及状态检测
• 2.6.2 单核巨噬细胞效应
• 第三章 实验结果
• 3.1 疏水界面诱导pCRP变构,呈现双抗原性
• 3.2 pCRP铺板后五聚体抗原性来源于后结合pCRP和变构分子
• 3.3 铺板pCRP与游离pCRP的结合机制及"变构分子"的获得方法
• 3.4 变构分子易于补体激活
• 3.5 变构分子具有与pCRP、mCRP不同的对单核巨噬细胞的刺激效应
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 附录
• 在学期间的研究成果
• 致谢