论文摘要
目的:血管性痴呆（Vascular Dementia,VD）是老年期痴呆的主要类型之一,它是由一系列脑血管因素（缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病等）导致脑组织损害引起的以认知功能障碍为特征的痴呆综合症,不仅给病人带来长期痛苦,严重影响其生活质量,而且给家庭、社会造成沉重负担,因此研究VD的发病机制以指导其防治具有很高的社会价值和现实意义。硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）是“一种臭鸡蛋气味的气体”,H2S不仅有毒性作用,它还广泛参与机体多种生理和病理过程,因此被认为是继一氧化氮（nitric oxide,NO）、与一氧化碳（carbon monoxide, CO）后的第三类气体信号分子。H2S不仅在神经系统发挥重要的生理作用,而且还作为一种内源性的抗氧化剂,在氧化应激时能够清除羟自由基等活性氧簇,对神经细胞起保护作用。本实验以VD大鼠模型为研究对象,观察大脑缺血再灌注不同时间对大鼠学习记忆能力的损伤程度、血清中H2S含量的改变及海马CA1区神经元细胞凋亡率及凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax的表达情况,从行为学、细胞凋亡及内源性H2S表达量及其相互关系等方面,探讨VD的发病机制,进一步认识H2S这个新的气体信号分子的作用,为VD的防治提供理论依据。方法:选用纯系健康雄性Wistar大鼠64只,将动物随机分为8组,正常组（Normal group）,假手术组（Sham-operated group）和VD模型组（VD group）,VD模型组又分为大脑缺血再灌注2小时组（IR 2h group）,大脑缺血再灌注8小时组（IR 8h group）,大脑缺血再灌注24小时组（IR 24h group）,大脑缺血再灌注72小时组（IR 72h group）,大脑缺血再灌注168小时组（IR 168h group）和大脑缺血再灌注720小时组（IR 720h group）,每组8只动物,采用四血管阻断法（4-VO）制作VD大鼠模型,假手术组麻醉及手术过程与VD模型组相同,但不电凝双侧椎动脉,不阻断双侧颈总动脉。采用Morris水迷宫法测试各组大鼠的学习记忆能力,以逃避潜伏期为观测指标;制作大脑HE切片,采用光镜观察各组大鼠海马CA1区的形态学变化;采用免疫组织化学染色法检测凋亡调控蛋白Bcl-2及Bax的表达情况,采用Motic 6.0数码医学图象分析系统测量海马CA1区阳性目标平均光密度,进行统计分析;采用流式细胞术检测海马神经细胞的凋亡率;采用亚甲蓝比色法检测血清中H2S的含量,实验数据用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。结果:⑴行为学:随着训练天数的增加,各组大鼠的逃避潜伏期均缩短,第二天各组大鼠的逃避潜伏期开始出现统计学差异,IR 720h组与正常组和假手术组比较逃避潜伏期明显延长（P<0.01）;正常组和假手术组逃避潜伏期差异无统计学意义（P>0.05）。⑵形态学改变:假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞完整,结构正常,胞浆丰富;细胞核呈圆形、椭圆形,无固缩或溶解现象;染色质在核内分布较均匀,间质无水肿表现。VD模型组大鼠海马CA1区可见大量神经元变性,体积变小,胞核与胞浆界限不清,核固缩成三角形或不规则形,而且随缺血再灌注时间的延长,变性神经元数目越多。⑶细胞凋亡蛋白表达:VD模型组缺血再灌注2小时后Bcl-2蛋白平均光密度值开始明显上调,缺血再灌注8小时达到高峰,之后开始下降,但IR 24h组仍高于假手术组（P<0.05）;缺血再灌注早期Bax在海马CA1区的表达明显增强,随着再灌注时间的延长,其表达量不断增加,IR 72168h达高峰（P<0.05）;随缺血再灌注时间的延长,Bcl-2/Bax的比率逐渐降低。⑷海马神经细胞凋亡率:VD模型组与假手术组比较,海马神经细胞凋亡率均增加（P<0.01）;VD模型组各组海马神经细胞凋亡率各不相同（P<0.01）;随着缺血再灌注时间的延长,大鼠海马神经细胞凋亡率逐渐增高,海马神经细胞凋亡率呈现对数曲线上升趋势。⑸血清H2S含量: VD模型组与假手术组和正常组比较,血清中H2S含量减少（P<0.01）;VD模型各组间血清H2S含量差异有显著性（P<0.01）;随着缺血再灌注时间的延长,大鼠血清H2S含量逐渐降低,血清H2S含量呈现直线降低趋势。⑹血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率相关分析:随着血清H2S含量的降低,海马神经细胞凋亡率逐渐升高,两者呈现明显的负相关,回归方程为:y =-0.135x + 12.068,相关系数r=-0.861（P<0.01）,提示内源性H2S可能对海马神经细胞具有保护作用。结论:脑缺血再灌注损伤可导致VD大鼠学习记忆功能的减退,海马神经细胞凋亡程度增强和血清中H2S含量减少;血清H2S含量与海马神经细胞凋亡率呈负相关,海马神经细胞凋亡程度可能与内源性H2S生成减少有关。