论文摘要
组蛋白的乙酰化/去乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等共价修饰对生物体的染色质结构和基因表达起着重要的调控作用。作为一种重要的组蛋白共价修饰,组蛋白甲基化在异染色质形成,X-染色体失活,转录调控等生命过程中起着非常重要的作用。DOT1催化一个独特的赖氨酸位点——组蛋白H3第79位赖氨酸(H3-K79)发生甲基化,是首个被发现的无SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基转移酶,代表了一类新的组蛋白赖氨酸甲基转移酶。与之前发现的组蛋白H3赖氨酸甲基化位点都位于组蛋白的N’末端不同,赖氨酸79是首个被发现的位于组蛋白H3的核心球体部位的甲基化位点。DOT1及H3-K79甲基化的特点决定了其可能具有重要的、特殊的生物学功能。在酵母中的研究表明,H3-K79甲基化在调控染色质结构、基因表达、转录、DNA损伤检验点等生命过程中起着重要的、特异的功能。相对于研究较为深入广泛的H3-K4、H3-K9等组蛋白N’末端的甲基化修饰,H3-K79甲基化在高等生物中的功能及调控机制尚研究较少。研究表明,H3-K4、H3-K9等组蛋白N’末端的甲基化修饰在卵母细胞和早期胚胎的生长发育中起着重要的作用。而H3-K79甲基化卵母细胞和早期胚胎的生长发育中的作用尚无研究。本实验研究了DOT1和组蛋白H3 Lysine 79甲基化在小鼠卵母细胞减数分裂中的作用,结果表明:(1)用抗组蛋白H3第79位赖氨酸甲基化的单克隆抗体进行免疫荧光分析,结果表明GⅤ期、GⅤBD期和MⅡ期卵母细胞细胞核中都有很强的荧光信号。GⅤBD期和MⅡ期卵母细胞细胞核中有较高程度的组蛋白H3第79位赖氨酸甲基化;而GⅤ期卵母细胞生发泡中组蛋白H3第79位赖氨酸甲基化呈分散的点状分布。用抗着丝粒蛋白的抗体CREST进行双重免疫荧光分析表明,GⅤ期卵母细胞生发泡中组蛋白H3第79位赖氨酸甲基化主要发生在染色体的着丝粒位置。(2)利用RNAi成功的抑制了mdotla基因的表达和H3-K79甲基化的发生。荧光定量RT-PCR分析表明,与control siRNA注射组和未注射组相比较,siRNA注射组mdotla的表达发生显著的下降(P<0.05)。siRNA注射组mdotla的表达量仅相当于未注射组mdotla的表达量的15.49%。control siRNA注射组和未注射组之间没有显著性差异。免疫荧光结果表明siRNA注射组卵母细胞检测不到或仅能检测到微弱的荧光信号。免疫荧光图像的相对定量分析表明,与control siRNA注射组和未注射组相比较,siRNA注射组H3-K79甲基化都发生显著的下降(P<0.05)。siRNA注射组H3-K79甲基化仅相当于control siRNA注射组H3-K79甲基化的19.54%。control siRNA注射组和未注射组之间没有显著性差异。(3)RNAi抑制mdotla基因表达和H3-K79甲基化后,小鼠卵母细胞减数分裂Ⅰ纺锤体组装也受到严重的影响。统计分析表明,siRNA注射组中有49.64%(69/139)的卵母细胞呈现异常的纺锤体形态,而control siRNA注射组和未注射组仅有16.22%(24/148)和14.01%(22/157)卵母细胞呈现异常的纺锤体形态。control siRNA注射组和未注射组之间没有显著性差异。(4)RNAi抑制mdotla基因表达和H3-K79甲基化后,小鼠卵母细胞减数分裂Ⅰ染色体排列和分离也受到严重的影响。统计分析表明,siRNA注射组中有61.15%(85/139)的卵母细胞呈现异常的染色体排列和分离,而control siRNA注射组和未注射组仅有16.89%(25/148)和15.92%(25/157)卵母细胞呈现异常的染色体排列和分离。control siRNA注射组和未注射组之间没有显著性差异。(5)RNAi抑制mdotla基因表达和H3-K79甲基化后,小鼠卵母细胞的成熟也受到严重的影响。统计分析表明siRNA注射组中卵母细胞排第一极体(PBⅠ)的比例显著的低于control siRNA注射组和未注射组(P<0.05),siRNA注射组中仅有22.32%(25/112)的卵母细胞排第一极体(PBⅠ),而control siRNA注射组和未注射组有66.13%(82/124)和69.47%(91/131)卵母细胞排第一极体(PBⅠ)。control siRNA注射组和未注射组之间没有显著性差异。因此,抑制mdotla基因表达和H3-K79甲基化,可以扰乱小鼠卵母细胞减数分裂Ⅰ纺锤体组装和染色体排列,导致减数分裂Ⅰ染色体的异常分离,阻止卵母细胞的成熟。这表明mDOTla和组蛋白H3第79位赖氨酸甲基化在哺乳动物卵母细胞减数分裂进程中起着重要的调控作用。
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相关论文文献
- [1].Dot1及其同源物的研究进展[J]. 复旦学报(医学版) 2018(04)
标签:干扰论文; 组蛋白赖氨酸甲基化论文; 卵母细胞论文; 减数分裂论文;