黄斑蓝子鱼固醇调节元件结合蛋白-1基因克隆及表达研究

论文摘要

固醇调节元件结合蛋白（Sterol regulatory element binding proteins, SREBPs）属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（bHLH-zip）转录因子家族,是真核细胞内调节脂肪代谢的关键转录因子。它有三个亚型:SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2。SREBP-2由SREBP-2基因编码,主要调控胆固醇生物合成,SREBP-1a和SREBP-1c由同一个基因SREBP-1编码,SREBP-1a调控所有SREBP应答基因,而SREBP-1c则负责调控脂肪酸生物合成。在鱼类营养学界一般认为,淡水硬骨鱼类可以通过脂肪酸的去饱和及碳链延长作用将18C亚油酸和α-亚麻酸转化为20-22C高度不饱和脂肪酸（HUFA）,而海水鱼的这种能力缺乏或很弱。然而,最近本课题组在黄斑蓝子鱼（Siganus canaliculatus）中首次发现和证明海水鱼具有将亚油酸和亚麻酸转化为HUFA的能力,且这种转化能力在低盐度水体中（10ppt）要比在高盐度水体中（32ppt）高;此外,本课题组也从黄斑蓝子鱼中克隆到控制HUFA合成的三个关键酶的基因（Fad2、Fad1、Elovl5）,同时证明饲料中亚麻酸与亚油酸对酶基因表达有促进作用。这提示,蓝子鱼的HUFA合成能力似乎兼具淡水鱼和海水鱼的特点,是研究鱼类HUFA合成代谢调控机制较理想的模式鱼类。为了研究蓝子鱼HUFA合成代谢的分子调控机制,本论文克隆了参与脂肪酸生物合成调控的重要转录因子SREBP-1的基因,并对其组织表达特异性及环境盐度对其mRNA表达水平的影响进行了研究。主要研究结果如下:1.采用RT-PCR、Tail-PCR和RACE-PCR方法获得蓝子鱼固醇调节元件结合蛋白-1 （SREBP-1）的cDNA全长为3913bp （在GenBank的登录号为JF502069）,其中5’端非编码区有200bp,3’端非编码区为200bp （不包括polyA）,编码区为3513bp,共编码1170个氨基酸。氨基酸序列具有典型的SREBP结构特性:包含一个bHLH-zip的结构。蓝子鱼的SREBP-1氨基酸序列与大西洋鲑鱼（Salmo salar）的同源性最高,为78%;其次是斑马鱼（Danio rerio）,同源性为75%;与其它物种（原鸡以及鼠、野猪、人等哺乳动物）的同源性为54%-57%。2.利用RT-PCR和real-time PCR方法进行组织表达特异性研究的结果显示,SREBP-1的mRNA表达水平在脑中最高,其次为眼、肠,在心脏、肝脏、鳃、脾和肌肉等组织较低。这表明,脑、眼和肠组织可能是黄斑蓝子鱼SREBP-1发生转录水平调控的主要部位。3.采用real time PCR方法对不同盐度下养殖的蓝子鱼的肝脏、肠、脑、眼睛、肌肉、脾等组织样品中SREBP-1的mRNA表达水平进行比较。结果显示,高盐度（32ppt）组鱼的肝脏、脾脏组织中的表达水平比低盐度（10ppt）组要高,前者分别为后者的1.26倍和1.24倍;低盐度组鱼肠、脑和眼睛组织中的表达水平分别是高盐度组的2倍、1.5倍和3.4倍;肌肉组织表达水平在两个盐度组相近。这说明,环境盐度对SREBP-1 mRNA表达水平的影响随组织不同而不同,对脑、肠、眼睛等HUFA合成较活跃的组织的影响较大。本研究首次在海水鱼类中克隆到SREBP-1基因,同时首次研究鱼体SREBP-1基因转录表达水平与环境盐度的关系。研究成果不仅对于丰富鱼类营养学、特别是分子营养学内容具有重要的理论意义和学术价值,而且有助于揭示蓝子鱼HUFA合成代谢的分子调控机制,也可为深入开展鱼类HUFA代谢调控机制的研究提供理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 固醇调节元件结合蛋白（SREBP） 及其功能简介
• 1.2 SREBP基因克隆及其调控作用的研究进展
• 1.2.1 SREBP基因克隆及其组织表达特性方面的研究进展
• 1.2.2 SREBP对脂肪代谢的调控作用
• 1.2.3 其它因子对SREBP表达的调控作用
• 1.3 蓝子鱼的生物学特性
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 蓝子鱼养殖及组织样品收集与保存
• 2.1.1 试验鱼的养殖
• 2.1.2 组织样品的收集与保存
• 2.2 蓝子鱼SREBP-1 全长cDNA的克隆
• 2.2.1 组织RNA提取及cDNA的第一链合成
• 2.2.2 SREBP-1 部分cDNA序列的获得
• 2.2.3 SREBP-1 cDNA 3’和5’端序列的获得
• 2.2.4 序列拼接与SREBP-1 全长cDNA序列的扩增
• 2.3 蓝子鱼SREBP-1 基因组织表达特异性的RT-PCR分析
• 2.4 蓝子鱼组织中SREBP-1 表达的定量分析
• 2.4.1 组织样品的RNA提取及cDNA第一链合成
• 2.4.2 组织样品中SREBP-1 mRNA含量的检测
• 第3章 结果与分析
• 3.1 蓝子鱼SREBP-1 全长cDNA及其蛋白的特性
• 3.1.1 SREBP-1 的核苷酸序列和氨基酸序列的一级结构
• 3.1.2 氨基酸序列同源性分析
• 3.1.3 氨基酸序列亲/疏水性分析
• 3.1.4 氨基酸序列跨膜特性分析
• 3.1.5 氨基酸序列的系统进化树分析
• 3.1.6 bHLH-zip结构域的二级结构及理化性质分析
• 3.2 蓝子鱼不同组织的SREBP-1 mRNA表达水平比较
• 3.3 不同盐度下蓝子鱼各组织中SREBP-1 的mRNA表达水平比较
• 第4章 讨论
• 4.1 蓝子鱼SREBP-1 的核苷酸和氨基酸序列的结构特性
• 4.2 蓝子鱼SREBP-1 基因的组织特异性分布
• 4.3 环境盐度对SREBP-1 基因mRNA表达的影响
• 第5章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录 pMD（?）18-T载体序列