大蒜二烯丙基三硫化物抗乳腺癌MDA-MB-231细胞血行转移的机制初探

论文摘要

目的和意义：大蒜二烯丙基三硫化物（Diallyl Trisulfide,DATS）是大蒜抗癌活性成分有机硫化物中的一种脂溶性成分,大量研究表明,大蒜有机硫化物具有预防和治疗肿瘤的作用,大蒜的防癌作用包括预防致癌物质活化和促进机体解毒,大蒜的肿瘤治疗作用则主要包括调节细胞周期,诱导细胞凋亡、抑制肿瘤转移、抗血管生成等方面。从国内外大蒜治疗肿瘤研究结果中发现,目前有关大蒜预防肿瘤发生、调节肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡等方面的机制研究较为全面,而关于其抗肿瘤转移作用研究从近十年起逐步引起人们的关注,但相关机制研究尚存在不足,大多停留在流行病学统计结果以及实验室整体动物研究水平。因此,本课题拟选取大蒜有机硫化物中的其中一种脂溶性成分二烯丙基三硫化物（Diallyl Trisulfide, DATS）,研究其对高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞血行转移能力的影响及其分子机制,为完善大蒜的抗肿瘤作用靶点,将其合理应用于临床提供相关的实验依据。研究方法：实验研究分为两大部分：第一部分考察DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞血行转移过程恶性生物学行为的影响。包括两个章节：第一章通过模拟肿瘤细胞侵袭降解基底膜阶段肿瘤-基质黏附,肿瘤在基质内移行,肿瘤降解基底膜等恶性生物学行为,建立肿瘤-基质黏附模型、肿瘤运动模型、肿瘤侵袭基底膜模型,考察DATS对乳腺癌细胞侵袭降解基底膜过程恶性生物学行为的影响。第二章模拟肿瘤细胞随血液运行过程,肿瘤血行转移过程与血小板活化聚集包裹肿瘤形成癌栓密切相关,涉及的恶性生物学行为包括：肿瘤-血小板黏附和血小板活化介导肿瘤移行,通过建立肿瘤-血小板黏附模型、血小板活化介导的肿瘤迁移模型等,考察DATS对乳腺癌细胞随血液移行阶段恶性生物学行为的影响。第二部分考察DATS影响乳腺癌MDA-MB-231细胞血行转移过程的分子机制。基底膜是癌细胞侵袭转移的天然屏障,基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）的表达对降解基底膜起重要作用,其活性是影响肿瘤侵袭和转移的重要因素之一。另一个方面,肿瘤黏附分为同质黏附和异质黏附,瘤细胞离开母体,侵袭基底膜发生血行转移时,异质黏附占主导地位,整合素家族（Integrins）主要参与肿瘤细胞的异质黏附过程并且具有调节肿瘤细胞MMPs表达和活性的功能。本部分运用Real-time PCR、RT-PCR技术,Western Blotting技术和ELISA技术考察DATS对乳腺癌细胞基质金属蛋白酶MMP2、MMP9及其抑制剂TIMP1,整合素Integrinβ1、β3在mRNA水平表达和蛋白水平表达的影响。研究结果：首先,应用MTT法检测DATS对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响,初步确定DATS的合理用药浓度（0.01μM-10μM）。其次,在MDA-MB-231细胞侵袭基底膜阶段,应用细胞染色法检测DATS对肿瘤细胞-基质黏附能力的影响,结果表明,DATS （0.01μM-10μM）可以在一定程度上抑制肿瘤细胞与细胞外基质（FN）的黏附,但是与对照组比较并无差异。应用划痕愈合实验和Transwell迁移小室检测DATS对肿瘤细胞运动迁移能力的影响,结果表明DATS可以抑制划痕的愈合并剂量依赖性抑制肿瘤细胞的运动,DATS浓度达5μM （P<0.01）,10μM DATS迁移抑制率达54.73%,应用Transwell人工重组基底膜侵袭小室检测DATS对肿瘤细胞侵袭能力的影响,结果表明随着药物浓度的升高,肿瘤细胞的侵袭力逐渐降低,DATS浓度达10μM（P<0.01）,侵袭抑制率达48.12%。第三,在MDA-MB-231细胞随血行移行阶段,应用体外血小板聚集实验,发现DATS对不同致聚剂诱导的血小板聚集作用均有抑制作用,其中DATS对PAF诱导血小板聚集的抑制作用最为强烈,结果呈剂量依赖性。应用放射免疫法进一步检测血小板活化聚集指标TXB2/6-keto-PGF1α的比例发现,DATS可以下调PAF活化血小板表面TXB2/6-keto-PGF1α的比值。应用细胞染色法检测DATS对肿瘤细胞-活化血小板黏附能力的影响,结果表明DATS可以剂量依赖性抑制二者的黏附,DATS浓度达10μM（P<0.001）,黏附抑制率达29.30%。应用Transwell小室和划痕愈合试验检测DATS对血小板活化介导的肿瘤迁移能力的影响,结果显示肿瘤细胞迁移能力随着浓度的增高逐渐降低,呈剂量依赖性,DATS浓度达10μM（P<0.01）,迁移抑制率达36.51%。最后,应用Real-time PCR、RT-PCR检测及western blotting蛋白印迹法检测DATS对基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）及其抑制剂（TIMP-1）,整合素（Integrinβ3、β1）的影响,我们发现DATS可以下调基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）,整合素（Integrinβ3）的表达,同时上调基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1的表达水平,并且DATS对于MMP2和TIMP1的调控最用最为强烈,但是对Integrinβ1的表达无甚影响、此外,运用ELISA技术考察DATS对MDA-MB-231细胞MMP2和TMIP1表达的调控作用,结果与上述实验一致。结论和意义：本研究有以下发现：①DATS可以抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞在组织中发生游离并与基底膜进一步发生侵袭的过程,继而抑制穿透基底膜的肿瘤细胞与血液系统中的血小板黏附形成肿瘤-血小板癌栓复合物,并随着血液的流动迁移至转移灶的整个过程。②DATS对于调控基底膜降解的关键因素基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）以及与肿瘤异质黏附密切相关的黏附分子整合素（Integrinβ1、β3）均具有不同程度的下调作用,其作用体现在抑制上述靶点的mRNA表达水平和蛋白表达水平,并且能够进一步上调肿瘤细胞中基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）的表达。通过上述结果,可以初步看出DATS可以抑制乳腺癌细胞的血行转移过程,其作用体现在两大方面：第一,DATS可以直接抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞从原发灶游离,并与基底膜发生黏附侵袭；第二,DATS可以通过抑制血小板活化聚集,阻断血小板包裹肿瘤细胞形成癌栓的功能,从而间接阻断肿瘤细胞在血管中发生移行。这一结论这对于进一步完善大蒜及其有机硫化物的抗肿瘤作用具有一定参考价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 绪论
• 一、以恶性程度高、转移复发率强的乳腺癌为研究对象
• 二、以大蒜为例探讨饮食结构与肿瘤的发生发展及恶化的相关性
• 三、定位肿瘤侵袭转移过程中的重要阶段
• 第一部分 DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞血行转移过程 #4恶性生物学行为的影响
• 第一章 DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞降解基底膜阶段 #4恶性生物学行为的影响
• 1. DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长数目的影响
• 2. DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞-基质（FN）黏附的影响
• 3. DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞运动迁移的影响
• 4. DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭基底膜的影响
• 第二部分 DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞血行转移过程 #18恶性生物学行为的影响
• 第二章 DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞血液运行转移阶段 #18恶性生物学行为的影响
• 1. DATS对PAF、ADP、Thrombin三种致聚剂诱导血小板聚集的影响
• 2及6-keto-PGF_1α的影响'>2. DATS对PAF活化血小板释放TXB₂及6-keto-PGF_1α的影响
• 3. DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞与PAF活化血小板黏附的影响
• 4. DATS对PAF活化血小板介导乳腺癌MDA-MB-231细胞运动迁移的影响
• 第三部分 DATS抗乳腺癌MDA-MB-231细胞血行转移的分子机制
• 1. DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞中Integrinsβ1,3,MMP2,9,TIMP1以及CXCR4 mRNA水平表达的影响
• 2. DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞中Integrinsβ1,3,MMP2,9以及TIMP1蛋白水平表达的影响
• 3. DATS对乳腺癌MDA-MB-231细胞上清液中MMP2和TIMP1释放量的影响
• 结论与讨论
• 文献综述
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间取得的学术成果
• 致谢