小麦及其近缘植物NPR1类似基因和反转录转座子基因片段的分离和特性分析

论文摘要

小麦白粉病、小麦纹枯病是小麦生产中最严重的病害之一,常造成巨大的经济损失。白粉病菌生理小种变异快,使用少数几个抗病基因进行抗性育种易引起寄主较快丧失抗性。而易于利用的小麦纹枯病抗源匮乏,抗性为多基因控制的数量性状,使其抗性育种进展缓慢。因此,研究寄主抗病反应分子机制,分离具有广谱作用的抗病信号传导调控基因,是目前抗病遗传育种发展方向之一。NPR1不仅对系统获得抗性（systemic acquired resistance,SAR）和诱导系统抗性（induced systemic resistance,ISR）起核心调控作用,而且也是基础抗性以及由抗病基因（resistance gene,R）决定的抗性反应中的重要调控因子,其过量表达可提高寄主对多种病害的抗性。已发现一些重要作物中都存在NPR1及其类似基因,NPR1及其类似基因介导的抗性可能是多种植物共同的保守途径。因此,克隆小麦及其近缘属NPR1及其类似基因对小麦白粉病和纹枯病抗性具有重大意义:由于小麦基因组庞大、重复序列多,使小麦基因的分离相当困难。研究发现防御相关的胁迫如水杨酸（salicylic acid,SA）、茉莉酮酸（jasmonic acid,JA）和病原菌等,可以激活反转录转座子的活性,活性的反转录转座子可以用来改良作物品种和作为基因标签分离基因和功能鉴定。本研究从白粉病菌诱导的小麦中分离到具有活性的反转录转座子,可为植物基因分离和功能鉴定提供有力的工具。 本研究取得以下研究进展: 1. 根据已克隆的其它植物的NPR1基因的保守序列设计引物,从白粉病菌诱导的中间偃麦草和粗山羊草中获得了NPR1类似基因片段,具有ANK结构保守序列,这两个基因分别命名为TiNH1和AsNH2。根据获得的TiNH1基因片段的序列设计RACE引物,通过RACE法获得了TiNH1的全长基因cDNA序列,同时从粗山羊草和普通小麦分别获得了NPR1类似基因的全长序列,分别命名为AsNH1和TaNH1。对TiNH1、TaNH1、AsNH1和AsNH2的序列比较发现:TiNH1、TaNH1和AsNH1编码蛋白的氨基酸之间的同源性在98%以上,它们存在垂直同源的关系;而它们与AsNH2的同源性仅84%,说明TiNH1、TaNH1和AsNH1与AsNH2是不同类型的NPR1类似基因。由此,推测中间偃麦草和粗山羊草里可能还存在其它NPR1类似序列。 2. 通过序列分析发现:TiNH1、TaNH1和AsNH1推导的蛋白质都具有已知NPR1蛋白的典型保守结构域POZ/BTB和ANK。对已报道的拟南芥、烟草、小麦、玉米的NPR1与TiNH1,TaNH1和AsNH1的氨基酸序列进行分析,结果表明:对NPR1功能起关键作用的氨基酸在不同物种不同基因产物间均具有保守性,如npr1-1（H）、npr1-2（C）和nim1-4（R）。TiNH1、TaNH1和AsNH1基因的5’端GC含量高达70%以上。进化树分析表明:TiNH1、TaNH1和AsNH1与水稻NPR1（Genbank accession:NM189701.1）关系密切,与美国专利报道的小麦NPR1同源序列（Patent number:WO0070069）关系较远,说明小麦中可能存在多个NPR1或类似基因序列。 3.以TiNH1作为探针,与不同病原处理的中间偃麦草总RNA进行Northern杂交分析,结果表明:TiNH1正常情况下有微量表达,但在小麦白粉病菌（Blumeria graminis）诱导下表达增强,

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 植物的抗病机制
• 1.1.1 植物防御反应中的信号分子
• 1.1.1.1 水杨酸
• 1.1.1.2 茉莉酸和乙烯
• 1.1.2 植物防御反应信号转导途径
• 1.1.2.1 依赖于水杨酸的防御信号转导途径
• 1.1.2.2 依赖于茉莉酸和乙烯的防御信号途径
• 1.1.3 植物防御反应信号转导途径拮抗及协同作用
• 1.2 NPR1基因的研究进展
• 1.2.1 NPR1基因的发现
• 1.2.2 NPR1编码蛋白质结构
• 1.2.3 NPR1植物抗病性中的关键作用
• 1.2.4 NPR1的抗病信号传导作用机制
• 1.2.5 NPR1在调节和平衡不同抗病信号传导途径中的作用
• 1.2.6 NPR1在植物广谱持久抗病的应用前景
• 1.3 瞬间表达技术快速分析基因功能
• 1.3.1 外源基因在植物细胞内的瞬间表达
• 1.3.2 瞬间表达方法
• 1.3.3 瞬间表达技术应用
• 1.3.3.1 植物抗病基因克隆
• 1.3.3.2 转录元件和转录因子克隆与分析
• 1.3.3.3 基因功能鉴定分析
• 1.3.3.4 基因产物定位分析
• 1.4 植物反转录转座子研究进展
• 1.4.1 反转录转座子基本特性
• 1.4.1.1 反转录转座子分类和结构
• 1.4.1.2 反转录转座子转座过程
• 1.4.1.3 植物反转录转座子是高等植物基因组重要组成成份
• 1.4.1.4 植物反转录转座子高度异质性与进化
• 1.4.1.5 植物反转录转座子的活性及其对基因组的影响
• 1.4.2 防御相关的胁迫激活反转录转座子活性
• 1.4.3 植物反转录转座子应用
• 1.4.3.1 植物反转录转座子在功能基因组学中的应用
• 1.4.3.2 植物反转录转座子在其他方面的应用
• 1.5 小麦白粉病研究进展
• 1.5.1 小麦抗白粉病基因研究背景
• 1.5.2 小麦抗白粉病基因克隆研究现状
• 1.6 小麦纹枯病研究进展
• 1.7 立题意义及技术路线
• 1.7.1 立题意义
• 1.7.2 技术路线
• 第二章 NPR1类似基因的分离、特性和功能分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 小麦材料
• 2.1.1.2 菌种及载体
• 2.1.1.3 酶及化学试剂
• 2.1.1.4 试剂盒
• 2.1.1.5 引物
• 2.1.2 方法
• 2.1.1.1 实验材料
• 2.1.2.2 总RNA的提取
• 2.1.2.3 cDNA的合成
• 2.1.2.4 PCR扩增
• 2.1.2.5 PCR产物的纯化
• 2.1.2.6 感受态细胞的制备
• 2.1.2.7 PCR产物的克隆测序
• 2.1.2.8 Northern杂交
• 2.1.2.9 Southern杂交
• 2.1.2.10 利用5’-RACE法延伸基因5’端
• 2.1.2.11 利用3’-RACE法延伸基因3’端
• 2.1.2.12 RT-PCR扩增cDNA全长
• 2.1.2.14 载体构建
• 2.1.2.15 离体叶片转化
• 2.1.2.16 接种、互作及电镜检测
• 2.1.2.17 序列分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 NPR1类似基因分离
• 2.2.1.1 总RNA样品的质量检测
• 2.2.2.2 NPR1类似基因保守片段分离
• 2.2.2.3 TiNH1、TaNH1和AsNH1基因全长获得
• 2.2.2 序列及进化树分析
• 2.2.2.1 NPR1类似基因保守区序列分析
• 2.2.2.2 TiNH1、TaNH1和AsNH1基因全长序列分析
• 2.2.3 TiNH1特性分析
• 2.2.3.1 TiNH1基因表达特性
• 2.2.3.2 TiNH1拷贝数分析
• 2.2.4 利用瞬间表达对TiNH1功能初步分析
• 2.2.4.1 表达载体构建
• 2.2.4.2 白粉病菌发育过程
• 2.2.4.3 报告基因在表皮细胞中表达过程
• 2.2.4.4 目标基因与白粉病菌互作效果分析
• 2.3 讨论
• 第三章 防御相关胁迫诱导的反转录转座子特性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 小麦材料
• 3.1.1.2 菌种及载体
• 3.1.1.3 酶及化学试剂
• 3.1.1.4 试剂盒
• 3.1.1.5 引物
• 3.1.1.6 测序
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 材料处理
• 3.1.2.2 总DNA和RNA的提取
• 3.1.2.3 cDNA的合成和PCR扩增
• 3.1.2.4 PCR产物的纯化、连接及转化
• 3.1.2.5 测序、比较和进化树分析
• 3.1.2.6 Southern和Northern分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 分离小麦中的反转录转座子RT酶片段
• 3.2.2 反转录转座子在小麦及其近缘属中的分类
• 3.2.3 Family4家族转录活性分析
• 3.2.4 Family4家族在小麦基因组中以多拷贝形式存在
• 3.3 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历