宽皮柑橘（Citrus reticulate Blanco）的遗传多样性及系统发育研究

论文摘要

分布在我国南岭山脉的野橘种质是我国重要的宽皮柑橘种质资源，不仅对研究我国宽皮柑橘的起源和演化，而且对引进野橘抗性性状进行宽皮柑橘育种来说，都具有重要的意义。宽皮柑橘地方品种是人们在柑橘栽培实践中，长期驯化和选择产生的一些栽培历史悠久的柑橘品种，这些种质中不仅蕴涵着优良的抗性和品质性状基因，而且同样是研究柑橘起源与演化的重要材料。为便于这些种质的有效收集和保存，并分析他们与我国宽皮柑橘起源的关系，本文以宽皮柑橘地方品种和野橘为试材，对我国宽皮柑橘和野橘的遗传多样性及系统发育关系进行了研究。获得的主要结果有：1．在对33份宽皮柑橘地方品种和19份野橘种质的遗传多样性研究中，共筛选出具有多态性的10对核基因组SSR引物和8对叶绿体基因组SSR引物，这些引物共扩增出60个核基因组SSR多态性条带和19个叶绿体基因组多态性条带。除分布于3组由7份种质所形成的组内种质外，核基因组SSR标记可将所有的种质区分开，包括2个不同的砂糖橘品系。2．位点多态性信息含量（Locus polymorphic information content，PIC）的计算结果表明，在叶绿体基因组和核基因组水平上，野橘种质的遗传多样性都要高于宽皮柑橘地方品种，在核基因组SSR水平上，二者的PIC值分别为0.6138和0.5091；在叶绿体基因组SSR水平上，二者的PIC值分别为0.4921和0.3769。3．利用Jaccard距离，通过UPGMA（The unweighted pair group method based on arithmetic averages，非加权对等平均法）法的聚类分析结果表明，在核基因组SSR水平上，宽皮柑橘地方品种聚成5组，野橘种质聚成2组；在叶绿体基因组水平上，宽皮柑橘地方品种和野橘种质都分别聚成2组：但叶绿体SSR和核SSR的聚类模式并不完全一致。通过分析叶绿体SSR和核SSR聚类模式上的差别，对一些地方品种的杂种起源进行了讨论。从聚类分析的结果还可看出，野橘种质中，崇义野橘与宽皮柑橘地方品种的关系最近，莽山野橘A类的种质距宽皮柑橘地方品种最远；宽皮柑橘地方品种中，茶枝柑与野橘种质聚在一起。4．系统发育分析所使用的3个序列中，trnL-trnF的序列长度为1009bp-1083bp，比对后序列长1157bp，其中，变异位点94个（0.081％），简约信息位点17个（0.015％）。matK区域的5’端3’端分别测序后合在一起用于进化树分析。5’端长733bp-748bp，3’端长779bp-789bp，合起来比对后的序列长1556bp，其中，变异位点136个（0.087％），简约信息位点26个（0.017％）。FLint2的序列长度为766bp-783bp，比对后的序列长795bp，其中变异位点91个（0.1145％），简约信息位点36个（0.0452％）。5．对3个DNA数据集进行的数据集间相容性分析结果表明，三个数据集间差异较大，不相容性较高。因此，分别构建了最大简约树（排除gaps和将gaps处理为新性状）、最大似然树、邻接距离树和trnL-trnF与matK联合数据集的最大简约树。根据建树的结果，对核DNA序列与叶绿体DNA序列间的不相容性与相关种质的杂种起源进行了讨论。6．构树的结果表明，尽管3个序列数据集构建出的进化树在拓扑结构上有些差异，但他们之间存在很多共同点。其中，大多数宽皮柑橘地方品种与大多数野橘种质能形成一个单系分支，即宽皮柑橘分支。宽皮柑橘地方品种中，滑皮柑、臭皮柑、夔柑、本地广橘、瓯柑5份种质为宽皮柑橘作父本，柚类或橙类作母本的杂种。宽皮柑橘地方品种中的青皮应与香橙为同一类种质。野橘种质中，莽山野橘A1和道县大果野橘5与宽皮柑橘分支成姐妹系。位于宽皮柑橘分支中的莽山野橘B0和江永野橘4与宽皮柑橘地方品种成并列分支，而道县小果野橘1、崇义野橘A1、江永粗皮野橘1和崇义野橘A2则在宽皮柑橘分支中形成一个进一步分化的单系分支。7．根据序列数据分析结果对与宽皮柑橘有关的一些生物型的起源进行了讨论。大多数结果与前人研究结果一致，但通过叶绿体基因组证据和核基因组证据的结合可进一步明确他们的父母本来源。在这些结果中，值得注意的有：1)大翼橙类的3份种质中，大种橙、宜昌橙与红河大翼橙在叶绿体基因组和核基因组上都有区别，并且能分别与其他种质形成分支，他们可能分别与宽皮柑橘、柚类或枸橼类的起源有关；2)金柑类种质宁波金柑和四季橘在叶绿体DNA数据集和核DNA数据集中都能形成一个分支，因此本研究中的3个DNA数据集不支持四季橘的起源与宽皮柑橘有关的假说。此外，本文还对人工合成柑橘嵌合体红江橙的几种分离类型进行了分子标记鉴定。研究中，使用了5种红江橙嵌合体材料，和叶绿体SSR、核SSR及RAPD等DNA分子标记。结果表明，1对叶绿体SSR引物和1个RAPD引物分别在5种红江橙材料中表现出多态性，谱带模式与嵌合体的结构有一定的联系。对RAPD特异引物片段回收测序后，根据序列丌发出相应的SCAR标记，可用于进一步的嵌合机理研究。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 研究目的和意义
• 1.1 研究意义
• 1.2 研究目的
• 1.3 技术路线
• 2. 文献综述
• 2.1 SSR标记及其在柑橘种质研究的应用
• 2.2 分子系统学概述
• 2.2.1 植物分子系统学分析方法
• 2.2.2 分子系统学中常用的叶绿体基因组DNA序列标记
• 2.2.3 分子系统学常用的核基因组DNA序列标记
• 2.2.4 分子系统学常用的线粒体基因组DNA序列标记
• 2.3 柑橘类果树种质的研究进展
• 2.3.1 真正柑橘类植物起源与演化
• 2.3.2 柑橘属果树的分类
• 2.3.3 柑橘属及部分种的起源与演化
• 2.3.3.1 大翼橙类与柑橘属的起源
• 2.3.3.2 柚
• 2.3.3.3 枸橼
• 2.3.3.4 甜橙和酸橙
• 2.3.3.5 藜檬
• 2.3.3.6 柠檬
• 2.3.3.7 莱檬
• 2.3.3.8 葡萄柚
• 2.3.3.9 粗柠檬
• 2.3.3.10 四季橘
• 2.3.3.11 香橙
• 2.3.4 宽皮柑橘类各品种间的遗传多样性及系统演化研究
• 2.3.4.1 宽皮柑橘的分类
• 2.3.4.2 宽皮柑橘的演化
• 2.3.4.3 宽皮柑橘一些生物型的起源
• 2.3.5 我国野橘种质的研究进展
• 2.3.6 柑橘分子系统发育研究进展
• 3. 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 SSR分析用的实验材料
• 3.1.2 测序分析用的实验材料
• 3.2 DNA的提取
• 3.3 SSR分析
• 3.3.1 PCR扩增及SSR标记的检测
• 3.3.2 SSR数据的统计分析
• 3.4 DNA序列性状分析
• 3.4.1 目的基因片段的扩增
• 3.4.2 序列片段的回收与克隆、测序
• 3.4.3 序列比对和处理
• 3.4.4 数据集间的相容性检验
• 3.4.5 最大简约树的构建
• 3.4.6 最大似然树的构建
• 3.4.7 邻接距离树的构建
• 3.4.8 系统发育树的KHTest和SHTest分析
• 4. 结果与分析
• 4.1 遗传多样性研究的结果与分析
• 4.1.1 核基因组SSR检测到的宽皮柑橘及野橘的多态性
• 4.1.2 叶绿体基因组SSR检测到的宽皮柑橘及野橘的多态性
• 4.1.3 基于核基因组SSR的宽皮柑橘及野橘的聚类分析
• 4.1.3.1 地方品种的聚类分析
• 4.1.3.2 野橘群体的聚类分析
• 4.1.4 基于叶绿体基因组SSR的宽皮柑橘及野橘的聚类分析
• 4.1.5 基于SSR的宽皮柑橘及野橘间的亲缘关系
• 4.2 DNA序列性状研究的结果与分析
• 4.2.1 叶绿体基因组matK基因片段的变异分析
• 4.2.2 叶绿体基因组trnL-trnF基因片段的变异分析
• 4.2.3 核基因组LEAFY第二个内含子（FLint2）序列变异的分析
• 4.2.4 数据集间的相容性
• 4.2.5 叶绿体基因组trnL-trnF基因片段的MP、ML和NJ系统树
• 4.2.6 叶绿体基因组matK基因片段的MP、ML和NJ系统树
• 4.2.7 叶绿体基因组trnL-trnF和matK联合数据集构建的MP系统树
• 4.2.8 核基因组LEAFY第二个内含子序列（FLint2）的MP、ML和NJ系统树
• 5. 讨论
• 5.1 地方品种及野橘种质间的遗传差异
• 5.2 野橘种质与宽皮柑橘的亲缘关系
• 5.3 一些柑橘生物型的起源
• 5.4 大翼橙类与现代柑橘的起源
• 5.5 DNA序列与柑橘系统发育研究
• 参考文献
• 致谢
• 附录一 在读期间发表的论文
• 附录二 红江橙嵌合体材料的遗传鉴定