论文摘要
【研究背景及目的】骨髓组织中存在有多种类型的干细胞,其中关于造血干细胞和间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的研究报道较多。MSCs是一种较原始的细胞,常维持在低分化状态。MSCs除参与构成造血微环境、支持造血细胞生长外,还具有多向分化潜能。最初只发现MSCs具有生成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等间质组织细胞的能力。近年来发现骨髓间质干细胞在特定的条件下还可以向心肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝细胞等分化。MSCs具有取材容易、体外增殖能力强、可分化为不同类型的成熟细胞和用于多种疾病治疗等特点,可以避免用胚胎干细胞和异基因干细胞治疗的伦理和免疫排斥等问题,因此它在临床治疗和人体生物组织工程研究方面比其它来源的干细胞更有优势,可能成为多种器官功能老化、组织损伤修复、功能细胞退行性变治疗以及人体生物组织构建的理想种子细胞。关于骨髓干细胞对肝组织修复的体内研究存在诸多争论:肝大部切除等急性肝损伤动物或患者有“外周血干细胞动员（peripheral blood stem cell mobilization）”现象。有文献证实骨髓干细胞能在体内分化为肝细胞参与组织修复,并可通过骨髓干细胞移植或外周血干细胞动员的途径促进肝损动物或病人的肝功能改善。但最近也有文献报道骨髓干细胞在体内并不能分化为肝细胞参与肝脏修复,却分化为纤维细胞而加剧肝纤维化的进展。这截然相反的两种结果的原因很可能是各组研究中宿主肝组织促分化微环境的不同所致。因而研究生理及病理条件下肝组织对干细胞增殖及分化的影响,以及阐明调控干细胞分化及成熟的适宜微环境对肝再生医学有重大意义。干细胞本身具有分化的多向性潜能和可塑性,其分化受主要由间质细胞和分泌的细胞因子和细胞外基质构成的微环境所调控。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）主要位于Disse间隙,是肝脏的主要间质细胞之一,并且具有树突状突起并嵌入相邻肝细胞的凹陷内,其突起包绕肝窦边界的内皮细胞。在损伤因子作用下,HSC能由静息状态活化增殖,分泌细胞外基质并分泌细胞因子对周围细胞产生强大调控作用,因而很有可能对干细胞的分化产生影响。不同状态的HSCs的调控作用可能是造成骨髓干细胞不同分化方向的原因。为证实该假设,我们将MSCs与静息状态及不同活化状态的HSCs共培养,对比观察不同状态的HSCs对MSCs分化的调控作用。为了进一步在体内环境下HSCs活化状态对肝再生及干细胞增殖分化的影响,我们采用2-乙酰氨基芴/肝大部切除（2-AAF/PH）模型诱导肝卵圆细胞（肝祖细胞）活化增殖,用免疫荧光方法验证卵圆细胞增殖过程中HSCs活化状态的变化及差异。并用Gliotoxin清除体内活化HSCs,对比研究清除活化HSCs对肝卵圆细胞活化增殖及肝脏再生的影响,进一步证实HSCs活化状态对干细胞分化增殖及肝再生的影响。【实验方法】一、原代分离大鼠骨髓MSCs并验证其多向分化潜能性我们采用梯度离心并培养贴壁的方法分离纯化骨髓MSCs,检测分离细胞活力及传代次数对细胞增值及分化潜能影响,诱导MSCs分别向脂肪细胞既成骨细胞分化,检测MSCs的多向分化潜能,挑选适合本试验诱导分化的细胞。二、原代分离获取大鼠HSCs、Kupffer细胞,构建不同激活程度的HSCs1.采用原位灌注消化获得肝非实质细胞,根据细胞密度差异及贴壁速度差别采用梯度离心获得原代HSCs和原代大鼠Kupffer细胞。免疫荧光标记Desmin检测HSCs纯度,吞噬试验检测Kupffer细胞纯度和活力;2.构建不同活化程度的HSCs,采用贴壁培养来获得半活化状态的HSCs,将HSCs与Kupffer细胞共培养的方式获得完全活化的HSCs。并采用Real-Time PCR检测肝细胞生长因子（hepatic growth factor,HGF）mRNA在各组HSCs的表达,以此研究不同状态HSCs对MSCs调控作用的差异。三、构建双层细胞共培养系统,检测不同活化状态的HSCs对MSCs分化的影响1.构建共培养系统,将MSCs分别与下列细胞五组细胞共培养:1)HSC-T6细胞;2)静息状态HSCs,为原代分离培养不多于5天的HSCs;3)贴壁活化的HSCs,为原代贴壁培养7-20天的HSCs;4)Kupffer细胞活化的HSCs:为按1:1比例与Kupffer细胞共培养7-20天的HSCs;5)原代分离的Kupffer细胞。2.镜下观察不同时间段各组MSCs形态学变化。3.检测肝细胞特异基因在诱导分化不同时段的各组MSCs中表达,包括肝细胞早期表达基因甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、磷酸化糖原合成酶（GS）及成熟肝细胞表达基因磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）、葡萄糖6磷酸酶（G6P）,判断各组MSCs是否向肝细胞分化及分化成熟过程。4.共培养第14天,免疫细胞荧光检测肝细胞特异蛋白在分化的MSCs中表达,包括ALB、AFP、CK-18及间质细胞标记α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,同时激光共聚焦法检测各组细胞在不同时间段是否存在共表达肝细胞标记白蛋白和胆管上皮标记细胞角蛋白19（CK-19）的细胞。5.用过碘酸-希夫氏液染色（PAS染色）检测各组MSCs在不同时间段的糖原合成,判断细胞是否具有成熟肝细胞的部分功能。四、对比研究肝卵圆细胞活化增殖过程HSCs活化状态的差异1.采用2-AAF/PH模型诱导肝卵圆细胞（肝祖细胞）增殖。2.荧光标记活化HSCs标记蛋白desmin,对比研究卵圆细胞活化增殖模型肝脏组织与对照组肝组织中HSCs活化状态的差别。五、Gliotoxin清除活化HSCs对干细胞增殖活化及肝再生影响1.2-AAF/PH造模,术后2天注射Gliotoxin,desmin免疫荧光染色证实活化HSCs的清除效果。2.对比研究清除活化HSCs后肝再生及卵圆细胞增殖所受影响。3.清除活化HSCs后,补充体外培养的活化HSCs培养上清,对比研究是否能抵消或部分抵消体内活化HSCs被清除对卵圆细胞增殖及肝再生的影响。【实验结果】一、原代分离骨髓MSCs,具有多向分化潜能采用梯度离心,贴壁培养及适时消化,每只大鼠可分离、纯化获得2-8×107MSCs,细胞存活率在95%以上,细胞均一性好纯度高。在适当诱导培养条件下,MSCs成功分化为脂肪细胞及成骨细胞。二、原代分离HSCs及Kupffer细胞及不同活化状态HSCs的获取1.原位灌注消化获得大鼠肝非实质细胞,梯度离心纯化获得大鼠的HSCs得率为2-8×107/肝。细胞存活率在90%以上,HSCs特异标记Desmin免疫荧光染色显示分离的细胞纯度)95%。2.通过梯度离心机及差异贴壁,成功获得大鼠Kupffer细胞,台盼蓝染色检查细胞存活率＞90%,吞噬墨汁实验检测细胞纯度＞95%。3.获取不同活化状态的HSCs,Real-Time PCR结果显示Kupffer细胞活化的HSCs及HSC-T6细胞的肝细胞生长因子mRNA表达明显高于静息状态HSCs的表达,而贴壁活化HSCs的HGF mRNA表达与静息状态HSCs比较无统计学差异。三、不同活化状态HSCs诱导MSCs定向分化的差异1.形态学上,与HSC-T6细胞共培养的MSCs,7天时观察到MSCs呈三角形或不规则形,14天左右分化为多边形细胞与Kuppfer细胞活化HSCs共培养的MSCs也观察到同样现象。而与静息HSC或贴壁活化HSCs共培养的MSCs逐渐展开呈纤维状细胞分化发展,未见到呈多边性细胞形成。单独与Kupffer细胞共培养的MSCs也呈纤维样细胞生长。2.与Kupffer细胞活化HSCs共培养的MSCs,7天时检测到AFP、ALB、CK-18、GS、TAT的mRNA表达,第14天表达程度无变化,到28天减弱。共培养28天的MSCs检测到成熟肝细胞特异表达基因PEPCK、G6P的表达。而与静息HSC或贴壁活化HSCs共培养的MSCs未检测到肝细胞系基因的表达。3.共培养第14天,与Kupffer细胞活化HSCs共培养的MSCs用免疫细胞荧光法检测到albumin、AFP和CK-18的表达,未检测到间质细胞标志α-SMA。而与静息状态HSCs共培养的MSCs及与贴壁活化HSCs共培养的MSCs未检测到肝细胞特异蛋白的表达,α-SMA强阳性表达。4.在与Kupffer细胞活化HSCs共培养14天的MSCs中,有12.4±3.7%的细胞同时表达肝细胞标志蛋白ALB和胆管上皮标志蛋白CK-19,表明该细胞具有肝细胞和胆管细胞的双向分化潜能性。随着时间迁移这种双标记细胞所占比例逐渐减少,至第4周已完全检测不到该双标细胞。5.与HSC-T6共培养MSCs在第4周用PAS染色检测到糖原沉积,到第6周达到最高峰,有55.4%±8.7%细胞检测到糖原沉积。与Kupffer细胞活化HSCs共培养的MSCs同样检测到糖原沉积,而与静息状态HSCs共培养的MSCs及与贴壁活化HSCs共培养的MSCs未检测到糖原沉积。四、卵圆细胞活化增殖过程中HSCs活化状态的变化1.2-AAF/PH模型成功诱导肝卵圆细胞活化增殖。2.卵圆细胞活化增殖过程中肝脏HSCs大量活化增殖,表达desmin,而对照正常肝脏及单纯肝部分切除小鼠肝脏仅见少量desmin阳性的活化HSCs。五、清除活化HSCs对卵圆细胞增殖及肝再生影响1.Gliotoxin有效清除体内活化的HSCs。2.Gliotoxin清除活化HSCs后,肝重指数明显小于单纯2-AAF/PH组,肝干/祖细胞标志基因CK-18、CD90、CD133、SOX-2表达水平明显低于单纯2-AAF/PH组,补充体外培养的活化HSCs培养上清后,肝重指数明显高于清除活化HSCs组,肝干/祖细胞标志基因的表达也得到部分恢复。【结论】1.密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,具有操作简单、快速、实用等优点,是一种较为有效的分离纯化MSCs方法。2.充分活化的HSCs能诱导MSCs向肝细胞分化,具有类似肝细胞形态,表达肝细胞特异基因和蛋白,具有肝细胞特有的糖原合成功能。3.活化HSCs诱导的MSCs定向分化是一个经肝细胞、胆管细胞双潜能细胞向成熟肝细胞逐渐分化和成熟的过程。4.肝卵圆细胞活化增殖过程伴随着HSCs的活化;5.HSCs的活化是肝再生及肝干/祖细胞增殖的必要环节。