GPC3基因绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及对SK-Hep-1肝癌细胞生物学特性的影响

论文摘要

GPC3与各种肿瘤关系密切,包括肝癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌等,在不同的肿瘤中发挥不同的作用,甚至可能起完全相反的作用。特别是在肝癌中,GPC3在肝癌中可能发挥重要的生物学功能。利用基因转染技术将目的基因转染到特定的细胞,观察目的基因的表达及对细胞生物学特性的影响,是目前应用最广,技术最成熟的基因研究方法。本研究应用载体构建技术构建了带有增强型绿色荧光蛋白标记的GPC3真核表达载体,利用基因转染技术和体外肿瘤侵袭迁移实验,从蛋白和基因水平探讨GPC3对肝癌细胞生物学性质的影响,并观察了GPC3对两种生长因子FGF2、IGF2细胞增殖效应的影响。一、GPC3绿色荧光蛋白真核表达载体的构建根据GenBank中查找的GPC3开放读码框（1740bp）,自行设计引物,应用PCR法克隆目的基因GPC3片断,PCR产物与pEGFP-N2质粒分别经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切、胶回收、连接,转化并挑取克隆送测序,结果成功构建了带增强型绿色荧光蛋白标记的重组质粒pEGFP-N2-GPC3。二、GPC3在SK-Hep-1肝癌细胞中的表达及GPC3对其生物学性质的影响在成功构建GPC3基因绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N2-GPC3系统的基础上,采用脂质体转染技术介导重组GPC3基因在SK-Hep-1细胞中表达,G418（600μg/ml）筛选获得稳定转染细胞,获得的细胞命名为GPC3-SK-Hep-1,并设空质粒对照组pEGFP-SK-Hep-1及空白对照SK-Hep-1,荧光显微镜下观察蛋白的表达情况,RT-PCR检测GPC3mRNA水平的表达。在确定GPC3基因已经成功转染到SK-Hep-1细胞中后,光境下观察基因转染组、空质粒对照组、空白对照组三组细胞的形态学特征,结果各组细胞形态无明显差异;MTT比色法检测转基因对SK-Hep-1细胞增殖的影响,基因转染组与对照组之间,差异有统计学意义（P<0.001）,空质粒对照组与空白对照组之间,差异无统计学意义（P>0.05）,GPC3抑制SK-Hep-1的增殖;黏附实验,基因转染组、空质粒对照组细胞与Matrigel胶的黏附率分别为（10.21±0.62）%、（15.13±0.83）%,基因转染组细胞黏附率明显下降（P<0.001）,抑制率为32.52%;迁移实验,200倍目镜下基因转染组细胞的穿膜细胞数为131.7±7.44。空质粒对照组细胞的穿膜细胞数为71.6±4.76,侵袭实验,200倍目镜下基因转染组细胞的穿膜细胞数为220±12.8。空质粒对照组细胞的穿膜细胞数为138±10.5。两组细胞相比较,迁移、侵袭能力均显著增强（P<0.001）;采用MTT法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2细胞增殖效应的影响,GPC3显著抑制FGF2介导的细胞增殖效应（P<0.05）,而IGF2介导的细胞增殖效应未见改变（P>0.05）,推测GPC3在FGF2信号通路中发挥负性调节因子的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 GPC3绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 pEGFP-N2-GPC3 转染SK-Hep-1 肝癌细胞及转基因细胞生物学特性的检测
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表（投稿）的论文目录