论文摘要
聚-β-羟基丁酸（Poly-β-hydroxybutyrate, PHB）是微生物在碳、氮等营养失衡的条件下合成的碳源与能源的高分子储存物（分子量50000-1000000）。作为微生物合成的可降解材料,PHB除了具有与化学合成高分子相似的理化性质,还具有一般化学合成高分子所没有的性质如光学活性、低透氧性、抗紫外辐射、生物可降解性、生物相容性、压电性和抗凝血性等,在工业、农业、环保、食品、医药等领域具有十分广阔的应用前景。如在医疗领域,PHB可以作为药物基质植入人体,以控制药物的释放,且最终降解产物为B-羟基丁酸,对人体没有任何毒副作用。本文从自然环境分离得到—株较高产PHB巨大芽孢杆菌菌株Bm-10,通过培养条件、培养基组分优化,提高PHB产量,发酵小试初步确定摇瓶发酵条件与发酵罐发酵条件的相对一致性；通过提取条件优化提高PHB的提取效率,从而最大化PHB产量；最后对实验中获得的提取物进行纯化分析,判断其结构、纯度等。首先,从浙江省各地（绍兴、宁波、金华、杭州、台州、丽水、温州）采集的土壤（主要来源有河底淤泥、排污口岸泥土、花坛土壤、菜地土壤等）中分离筛选芽孢杆菌菌株416株。通过对PHB的定性、定量筛选等手段获得较高产PHB菌株,同时进行连续传代培养以获得PHB产量及遗传性状稳定的目的菌株。其次,采用单因素法优化发酵条件,培养基中的碳源、氮源及两者比例。利用响应面法研究对PHB产量影响较大的4个因素（蔗糖浓度、牛肉膏浓度、初始pH、培养温度）之间的交互关系以及最佳值。利用响应面法建立回归方程。通过计算获得最优发酵条件为：初始pH为7.40,培养温度为29.81℃,蔗糖浓度为48.48 g/L,牛肉高浓度为26.06 g/L。经过单因素及响应面优化后Bm-10的PHB产量为5.308 g/L,比筛选时PHB产量（0.76g/L）提高6.98倍。第三,在摇瓶发酵条件优化的基础上,研究菌株Bm-10应用于工业化的潜力。以菌体情况、PHB产量、PHB所占菌体百分比及溶氧情况为检测指标,在3.7L发酵罐上进行研究,为实验室后期优化生产PHB打下一定基础。第四,为了尽可能的使PHB产量最大化,还对提取工艺进行了初步研究。主要从单因素实验的基础上再进行响应面优化提取条件。从单因素实验得出当提取液中氯仿浓度75%,提取温度60℃,提取时间3.0 h。通过响应面法优化PHB提取条件,得到一个二次多项式回归模型（R2=0.9953）,模型失拟项不显著（P=0.058>0.05）,拟合度良好,这说明采用响应面法得到的工艺参数较为可信。最终结果表明PHB的最佳提取条件：氯仿浓度69.7%,提取温度59.7℃,提取时间3.0 h。最后,将实验提取获得的粉末状或薄膜状固体采用紫外吸收光谱（UV）、核磁共振（NMR）等手段进行了分析,并与标准品进行比较。紫外吸收光谱中无杂质峰并且与PHB标准品的吸收峰一致,证明提取产物较纯,初步确定该提取物为PHB类似物,在浓硫酸降解过程中出现巴豆酸；核磁共振中的氢谱和碳谱分析可知,该提取物的结构为—[—O—CH（CH3）—CH2—CO—-]—-n。综合结果表明,从巨大芽孢杆菌内提取获得的物质为聚-β-羟基丁酸（PHB）并且纯度接近100%。
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摘要ABSTRACT目录第一章 文献综述1 PHB概述1.1 PHB的结构与性质1.2 PHB研究的必要性2 PHB的应用2.1 PHB的生理功能2.2 PHB在生产上的应用3 PHB的合成3.1 PHB的生物合成3.2 活性污泥生产PHB3.3 化学合成PHB3.4 转基因植物生产PHB4 PHB降解4.1 热降解4.2 生物降解5 PHB研究进展5.1 应用研究5.2 国内外应用基础研究6 立项背景7 研究内容及目的7.1 主要研究内容7.2 研究目的7.3 技术路线第二章 高产PHB芽孢杆菌菌株培育1 材料与仪器1.1 菌株来源1.2 培养基1.3 药品及仪器2 实验方法2.1 菌株的分离2.2 产PHB菌株的初筛2.3 PHB含量测定及目的菌株确定2.4 菌株形态鉴定及染色鉴定2.5 菌株的生理生化性质鉴定2.6 16S rDNA的PCR扩增、序列测定和系统发育分析3 结果与分析3.1 芽孢杆菌的分离纯化3.2 定性筛选含PHB芽孢杆菌3.3 定量筛选及目的菌株确定3.4 菌株的鉴定4 讨论第三章 PHB发酵培养基主要组分及摇瓶培养条件优化1 材料1.1 菌种1.2 培养基配方1.3 仪器与药品2 实验方法2.1 氮源对PHB产量的影响2.2 碳源对PHB产量的影响2.3 接种量对PHB产量的影响2.4 培养时间对PHB产量的影响2.5 摇床转速对PHB产量的影响2.6 培养温度对PHB产量的影响2.7 初始pH对PHB产量的影响2.8 碳氮源浓度对PHB产量的影响3 结果与分析3.1 氮源对Bm-10菌株PHB产量的影响3.2 碳源对Bm-10菌株PHB产量的影响3.3 接种量对PHB产量的影响3.4 培养时间对PHB产量的影响3.5 摇床转速对PHB产量的影响3.6 培养温度对PHB产量的影响3.7 初始pH的影响3.8 碳氮源浓度对PHB产量的影响4 讨论第四章 响应面法优化PHB发酵条件1 材料1.1 菌种1.2 培养基配方1.3 仪器与药品2 实验方法2.1 菌体培养2.2 菌体预处理2.3 PHB的测定2.4 Box-bohnken实验设计3 结果与分析3.1 数学模型的建立3.2 响应面及等高线分析结果4 讨论第五章 发酵小试1 材料1.1 菌种1.2 培养基配方1.3 仪器与药品2 实验方法2.1 菌体培养2.2 摇瓶放大实验2.3 上罐测定2.4 菌体干重测定2.5 PHB的测定3 结果与分析3.1 摇瓶放大实验3.2 上罐发酵4 讨论第六章 聚-β-羟基丁酸（PHB）提取工艺的优化1 材料与方法1.1 实验菌种1.2 培养基1.3 仪器与药品2 实验方法2.1 菌体培养2.2 菌体预处理2.3 PHB的测定2.4 细胞破碎法对PHB提取的影响2.5 提取温度对PHB提取的影响2.6 提取时间对PHB提取的影响2.7 提取液配比对PHB提取的影响2.8 响应面优化提取条件3 结果与分析3.1 细胞破碎法对PHB提取的影响3.2 提取温度对PHB提取量的影响3.3 提取时间对PHB提取量的影响3.4 氯仿浓度对PHB提取量的影响3.5 响应面优化实验4 讨论第七章 PHB纯化分析1 材料1.1 实验菌种1.2 培养基1.3 仪器与药品2 实验方法2.1 菌体培养2.2 PHB的提取纯化2.3 紫外吸收光谱分析2.4 核磁共振分析3 结果与分析3.1 PHB的提取纯化3.2 紫外吸收光谱分析（UV）3.3 核磁共振分析PHB结构4 讨论第八章 小结与建议1 小结2 建议参考文献附录 巨大芽孢杆菌Bm-10的来源、鉴定及发酵情况攻读学位期间取得的研究成果致谢
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