水稻叶片衰老特异性启动子的克隆和利用及剑叶早期衰老上升表达基因的鉴定

论文摘要

水稻是人类最重要的粮食作物之一。虽然目前杂交水稻的推广很大程度上解决了世界人民的粮食问题,但是一些优良品种尤其是一些籼型品种在中后期衰老快,限制了更多有机物的形成和积累,不利于结实率和千粒重等产量相关性状的提高。解决这个问题的关键是了解叶片衰老的机制,创造延缓水稻叶片衰老的途径,进而提高有机物在籽粒中的积累。利用衰老特异性启动子驱动细胞分裂素基因表达、抑制衰老上升基因表达或者过量表达衰老下降基因都有可能实现持绿性水稻的目标。本实验针对这个问题,克隆鉴定了水稻来源的衰老特异性启动子,并用该启动子驱动农杆菌来源的细胞分裂素合成酶基因转化籼稻和粳稻,筛选持绿性家系,并且构建了中花11剑叶的早期衰老上升表达文库,主要结果如下:1.克隆水稻启动子PSAG39,通过报告基因GUS融合表达载体转化水稻鉴定其时空组织特异性表达谱。经过组织化学鉴定发现其在叶、茎、根、花、颖壳及未成熟种子的种皮、愈伤组织中表达,在成熟种子及胚乳中不表达,而且在叶片衰老晚期表达量达到高峰,揭示该启动子是叶片衰老特异性,而且可以应用于基因工程育种改良研究。2.鉴于启动子序列预测出多种激素响应相关的顺式作用位点,本实验用瞬时表达体系检测激素和冷胁迫对一系列5’端缺失启动子的表达情况,并且研究了缺失启动子的衰老特异性表达谱,确定PSAG39启动子的衰老相关的顺式作用位点存在的区段。通过凝胶阻滞实验鉴定了可能对衰老上升表达起作用的顺式因子。揭示顺式作用位点HBOXCONSENSUSPVCHS和WRKY71OS与叶片衰老特异表达有关。3.在粳稻中成功转化了PSAG39:IPT表达系统,繁殖并筛选了单拷贝插入的转基因纯合家系,5个以牡丹江8#为受体:MT1、MT2、MT3、MT4、MT5:3个以中花11为受体:ZT1、ZT2、ZT3。4.研究转PSAG39:IPT表达系统的阳性转基因水稻的叶片持绿性变化,发现持绿性增强,且这个表型与外源基因IPT的表达量共分离。5.调查了转化植株表达的细胞分裂素在光照下对幼苗生长及抽穗期产生的影响,PSAG39:IPT的转基因植株表达细胞分裂素在一定光照条件下（14小时或24小时）影响了种子刚萌发时芽的生长,但是不会影响茎杆的继续伸长。在长日照条件下,转基因中花11植株表达细胞分裂素刺激了OsMADS50的表达,从而提前开花。6.探明结实期间碳氮代谢水平是否发生变化,通过分析纯合家系ZT1可溶性糖含量和全氮含量发现,糖及氮素水平的改变引起叶片的库源转换发生变化从而引发叶片衰老。7.完成纯合家系的随机区组试验,每个小区设置三个重复,调查转基因植株的持绿性和其他农艺性状。转基因阳性株系ZT1、ZT2的生物学产量相对其阴性株系降低约8-10%,千粒重增加约5-9%。8.以绿色叶片为driver,早期衰老叶片为tester,用抑制差减杂交法完成水稻剑叶早期衰老特异基因文库的构建,以driver和tester的总RNA为探针分别进行文库克隆的Macroarray杂交,筛选出815个差异表达的ESTs。通过生物信息学分析（阳性克隆聚类及GO分析）,一共确定了533个单基因,其中183个有GO注释,涉及大分子物质代谢、调控蛋白质合成、能量代谢、调节基因、解毒、病原性和逆境、细胞骨架构成和花发育。121个与已报导过的持绿相关QTLs共线性,其余是功能未知的新基因。9.从文库中随机挑选50个阳性克隆的Northern杂交验证了差减杂交的效率和准确度,达到60%以上。对几个未知功能的基因进行定量PCR实验,发现它们不仅在自然衰老早期上升表达,而且不同程度的受到激素的诱导。这些基因为阐明衰老机制提供了一定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACTS
• 1 文献综述
• 1.1 植物叶片衰老机理研究进展
• 1.1.1 叶片衰老的特点
• 1.1.1.1 叶片衰老包含PCD的过程
• 1.1.1.2 叶片衰老不同于普通PCD过程
• 1.1.2 衰老相关基因
• 1.1.2.1 衰老相关基因的类型
• 1.1.2.2 一类特殊的衰老相关基因-半胱氨酸蛋白酶基因
• 1.1.2.3 水稻中克隆的衰老相关基因
• 1.1.3 引起植物叶片衰老的原因
• 1.1.3.1 内部因素调节植物叶片的衰老
• 1.1.3.2 外部因素调节植物叶片的衰老
• 1.1.4 植物叶片衰老的分子机制
• 1.2 抗衰老工程研究进展
• 1.2.1 研究抗衰老作物的意义
• 1.2.2 抗衰老工程的发展历史
• 1.3 植物启动子结构与功能研究
• 1.3.1 启动子结构与特征
• 1.3.1.1 结构与特征简介
• 1.3.1.2 植物启动子的保守元件
• 1.3.1.3 植物启动子特异元件
• 1.3.2 植物基因工程中的常用启动子
• 1.3.2.1 组成型启动子
• 1.3.2.2 特异性启动子
• 1.3.3 启动子分离的技术方法
• 1.3.3.1 启动子预测
• 1.3.3.2 PCR的方法克隆启动子
• 1.3.3.3 启动子陷阱
• 1.3.3.4 聚合酶保护法
• 1.3.4 启动子功能检测
• 1.3.4.1 启动子强弱的定性定量分析
• 1.3.4.2 缺失分析
• 1.3.5 鉴定启动子DNA上反式作用蛋白结合位点的方法
• 1.3.5.1 酵母单杂交技术
• 1.3.5.2 凝胶阻滞实验（gel retardation assay）
• 1.3.5.3 DNase I足迹实验
• 1.3.5.4 其他鉴定方法
• 1.4 常见功能基因组研究方法
• 1.4.1 基因表达谱分析技术
• 1.4.1.1 微阵列技术（microarray）
• 1.4.1.2 基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression,SAGE）
• 1.4.1.3 cDNA-AFLP
• 1.4.1.4 差异展示PCR（Differential Display Reverse Transcription PCR,DDRT-PCR）
• 1.4.1.5 抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）
• 1.4.2 基因功能丧失方法（Loss of function）
• 1.4.2.1 物理化学诱变
• 1.4.2.2 反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）和双链RNA干扰（double-stranded RNA interference,dsRNAi）
• 1.4.2.3 插入突变
• 1.4.3 基因功能增加方法
• 1.4.3.1 基因超量表达（Over-expression）
• 1.4.3.2 诱导表达（Inducible expression）
• 1.4.3.3 基因异位表达
• 1.5 植物遗传转化方法及特点
• 1.5.1 基因枪介导的遗传转化
• 1.5.2 PEG介导的遗传转化
• 1.5.3 花粉管通道法
• 1.5.4 根癌农杆菌介导的遗传转化
• 1.6 研究的目的和意义
• 2 水稻叶片衰老特异性启动子的克隆和利用
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 受体植物材料
• 2.2.2 菌株、质粒、及外源片段
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 启动子序列分析
• 2.3.2 启动子全长和缺失片段的获得
• 2.3.3 IPT植物表达载体的构建
• 2.3.4 农杆菌介导的的遗传转化
• 2.3.5 DNA的抽提及Southern杂交
• 2.3.6 转基因纯合阳性和阴性株系的筛选
• 2.3.7 总RNA的抽提及操作
• 2.3.8 启动子的瞬时表达系统
• 2.3.9 GUS的定量及定性分析
• 2.3.10 激素处理
• 2.3.11 启动子片段凝胶阻滞分析（EMSA）
• 2.3.11.1 核蛋白的抽提
• 2.3.11.2 凝胶阻滞（gel retardation assay）
• 2.3.12 氮含量的分析
• 2.3.13 可溶性糖含量的分析
• 2.3.14 纯合转基因株系持绿性的田间调查及农艺性状的考察
• 2.3.14.1 田间试验设计
• 2.3.14.2 农艺性状的考察
• 2.3.14.3 持绿相关性状考查分析方法
• 2.4 结果与分析
• SAG39启动子序列分析'>2.4.1 P_SAG39启动子序列分析
• 2.4.2 全长启动子的表达模式
• 2.4.3 缺失启动子的表达模式
• SAG39启动子上衰老相关的顺式作用位点'>2.4.4 鉴定P_SAG39启动子上衰老相关的顺式作用位点
• SAG39:IPT转化植株纯合家系的筛选'>2.4.5 P_SAG39:IPT转化植株纯合家系的筛选
• SAG39:IPT转化植株的持绿性共分离检测'>2.4.6 P_SAG39:IPT转化植株的持绿性共分离检测
• SAG39:IPT转化植株的幼苗生长情况'>2.4.7 P_SAG39:IPT转化植株的幼苗生长情况
• SAG39:IPT转化植株的随机区组试验'>2.4.8 P_SAG39:IPT转化植株的随机区组试验
• SAG39:IPT转化植株的抽穗期变化'>2.4.8.1 P_SAG39:IPT转化植株的抽穗期变化
• SAG39:IPT转化植株的碳氮代谢发生变化'>2.4.8.2 P_SAG39:IPT转化植株的碳氮代谢发生变化
• SAG39:IPT转化植株的农艺性状调查'>2.4.8.3 P_SAG39:IPT转化植株的农艺性状调查
• 2.5 讨论
• SAG39是衰老特异性表达启动子同时具有胚乳特异不表达的特点'>2.5.1 P_SAG39是衰老特异性表达启动子同时具有胚乳特异不表达的特点
• SAG39的应用'>2.5.2 启动子P_SAG39的应用
• SAG39启动IPT的表达量比GUS低很多'>2.5.3 P_SAG39启动IPT的表达量比GUS低很多
• 2.5.4 抗衰老水稻工程研究前景展望
• 2.5.5 实验过程中的一点体会
• 3 水稻剑叶早期衰老上升表达基因的鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 总RNA抽提和mRNA分离
• 3.2.3 PCR-select cDNA差减文库的构建
• 3.2.4 Macroarray筛选差异表达基因
• 3.2.5 序列分析
• 3.2.6 Northern杂交分析
• 3.2.7 Quantitative reverse transcription（qRT）-PCR和RT-PCR分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 RNA含量和质量的检测
• 3.3.2 接头连接效率的检测
• 3.3.3 文库插入片段的检测
• 3.3.4 消减效率的检测
• 3.3.5 差异表达基因筛选
• 3.3.6 剑叶衰老早期上升表达克隆的序列分析
• 3.3.7 高丰度的叶片早期衰老基因
• 3.3.8 SSH文库基因与持绿性QTLs的共线性
• 3.3.9 几个未知功能的基因对激素有响应
• 3.4 讨论
• 3.4.1 行使几类主要功能的基因
• 3.4.1.1 大分子物质代谢
• 3.4.1.2 调控蛋白质合成
• 3.4.1.3 花发育
• 3.4.1.4 调节基因
• 3.4.1.5 能量代谢
• 3.4.1.6 病原与逆境
• 3.4.1.7 解毒
• 3.4.2 与持绿性QTLs共线性的基因
• 3.4.3 未知功能的基因与激素途径的关系
• 3.4.4 与拟南芥衰老文库的比较
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢