抗乙型流感病毒卵黄抗体的制备及其生物活性鉴定研究

论文摘要

流行性感冒是最常见的急性病毒性疾病之一,病患者会出现不同的程度的全身性症状如轻度疲劳、呼吸衰竭、甚至死亡。大约10-20%世界人口受季节性流感影响,每年导致250,000-500,000人死亡。乙型流感病毒是引起季节性流感的局部爆发的主要病原体之一。儿童感染乙型流感病毒,接受阿司匹林治疗后可能会产生一种罕见的Reye’s,综合症,对大脑和肝脏均有严重影响。目前在预防和治疗乙型流感病毒感染方面,医药界已经付出很多努力。抗病毒药物,如神经氨酸酶抑制剂,被广泛用于治疗流感。然而,乙型流感病毒对这些药物日益具有耐药性。虽然接种疫苗可以提供保护作用,但是现有的疫苗几乎没有治疗方面的效果。近年来,人们基于被动免疫治疗的原理,制备特异性卵黄抗体（IgY）代替抗生素治疗病原菌和病毒引起的多种疾病,具有安全、无耐药性和成本低廉等优点。本研究以灭活乙型流感病毒免疫产卵母鸡,PEG沉淀法和硫酸铵盐析分离纯化特异性IgY抗体。然后通过SDS-PAGE、ELISA分析抗体纯度和效价；以琼脂扩散法和Western blot检测IgY对病毒颗粒及其功能蛋白的特异性反应；以血凝抑制试验和病毒空斑减数试验研究其体外抗病毒活性；通过动物实验研究其体内抗病毒活性。此外,本研究还制备了IgY抗体量子点探针,进行乙型流感病毒检测方面的探索。结果表明,首次免疫两周后,鸡卵黄中即可检测到抗体效价；初次免疫5周后效价逐步上升到峰值1：3200。经两步PEG沉淀提取和硫酸铵盐析纯化,每毫升卵黄可获得5.2mg IgY,纯度为98.2%；琼脂扩散试验和Western blot表明制备的特异性IgY不但能够沉淀病毒颗粒,而且对病毒膜蛋白神经氨酸酶和血凝素及其亚基均有特异性反应。体外抗病毒试验显示,IgY抗体血凝抑制效价为1：128,对活病毒的半数抑制浓度达到1.68mg/mL。动物试验证明,特异性IgY抗体能够清除攻毒小鼠肺部病毒从而降低病毒滴度及减轻病症。IgY量子点探针检测病毒结果表明,病毒蛋白含量与荧光强度之间存在线性关系,最低检测病毒浓度为2.834×10-7mg/mL。综上,本研究成功研制了高纯度和特异性的抗乙型流感病毒IgY抗体,该抗体在体内外均有抗病毒活性,在免疫诊断检测中有较高灵敏度。为IgY抗体作为抗流感药物和诊断试剂的应用开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• CONTENTS
• 缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 卵黄抗体概述
• 1.1.1 禽类生产抗体的特点
• 1.1.2 IgY的结构及免疫化学性质
• 1.1.3 IgY分子的稳定性
• 1.1.4 IgY的应用
• 1.2 乙型流感病毒的概述
• 1.2.1 病毒形态及分子生物学
• 1.2.2 病毒的特性
• 1.2.3 病毒谱系的划分和演变
• 1.2.4 病毒的检测
• 1.2.5 乙型流感的预防与治疗
• 1.3 本研究目的意义及主要内容
• 1.4 课题来源
• 第二章 抗乙型流感病毒IgY的制备
• 2.1 前言
• 2.2 试剂与仪器
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 实验溶液配制
• 2.2.3 实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 病毒的培养及纯化
• 2.3.2 抗原制备及动物免疫
• 2.3.3 IgY的提取及纯化
• 2.3.4 酶联免疫吸附分析
• 2.3.5 SDS-PAGE
• 2.3.6 IgY蛋白含量测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 抗体产率及纯度
• 2.4.2 抗体效价的变化
• 2.4.3 抗体特异性
• 2.5 本章小结
• 第三章 IgY体外抗病毒活性
• 3.1 前言
• 3.2 试剂与仪器
• 3.2.1 材料与试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 琼脂扩散试验
• 3.3.2 免疫印迹试验
• 3.3.3 血凝抑制试验
• 3.3.4 空斑减数试验
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 IgY对病毒的免疫沉淀作用
• 3.4.2 IgY对病毒膜蛋白的特异性结合作用
• 3.4.3 IgY的血凝抑制作用
• 3.4.4 IgY抑制病毒体外复制
• 3.5 本章小结
• 第四章 IgY的体内抗病毒活性
• 4.1 前言
• 4.2 试剂与仪器
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 小鼠的感染及治疗
• 4.3.2 小鼠肺部病毒核酸的测定
• 4.3.3 小鼠肺部病毒滴度的测定
• 4.3.4 小鼠肺组织病理学分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 IgY治疗小鼠体重变化
• 4.4.2 IgY对攻毒小鼠的保护作用
• 4.5 本章小结
• 第五章 IgY在病毒检测中应用
• 5.1 前言
• 5.2 试剂与仪器
• 5.2.1 实验材料与试剂
• 5.2.2 实验溶液配制
• 5.2.3 实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 兔抗血清制备
• 5.3.2 量子点荧光探针制备
• 5.3.3 乙型流感病毒免疫检测
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 兔抗血清效价
• 5.4.2 量子点荧光光谱
• 5.4.3 量子点探针分子量及发光性质
• 5.4.4 量子点探针免疫吸附检测病毒
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表文章和专利
• 致谢