嗜酸乳杆菌高密度培养及冻干保护剂的研究

论文摘要

益生菌食品拥有全球最大的功能性食品市场,嗜酸乳杆菌是目前开发的益生菌之一。嗜酸乳杆菌菌粉广泛应用于食品和医药工业。本课题通过对嗜酸乳杆菌高密度培养及冻干保护剂的研究以达到提高嗜酸乳杆菌菌粉活菌数、实现工业化生产及降低产品成本的目的。论文优化了MRS（De Man Rogosa and Sharpe）培养基,探讨了嗜酸乳杆菌的培养方式,通过优化冻干保护剂及添加抗冷冻因子制备得到高活菌数的嗜酸乳杆菌菌粉,探讨了菌粉不同条件下的贮藏效果。通过单因素试验研究了氨基酸、糖类物质、还原性物质及天然提取物对嗜酸乳杆菌生长的影响。结果表明谷氨酸、精氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、胡萝卜汁、番茄汁及香菇汁能促进嗜酸乳杆菌的生长。通过响应面优化试验得到改良MRS培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏8g/L、酵母浸粉6 g/L、葡萄糖21 g/L-22 g/L、磷酸氢二钾3.3 g/L、柠檬酸氢二氨2 g/L、无水乙酸钠6 g/L-6.25 g/L、硫酸镁2g/L、吐温-80 1ml/L及硫酸锰0.05 g/L。优化得到的培养条件为：接种量5%,培养时间18h,培养温度为37℃,厌氧静置培养。加碱中和培养方式培养嗜酸乳杆菌活菌数可达5.3×109cfu/mL,与不添加碱组相比提高2倍以上。对嗜酸乳杆菌培养方式研究发现细胞循环培养可使发酵液活菌数达到3.5×1010 cfu/mL-3.6×1010 cfu/mL。嗜酸乳杆菌代谢物的积累是抑制其生长的首要因素。单因素试验探讨了冻干工艺条件,结果发现6000r/min×10min离心收集菌体,静置30min,-35℃预冻24h,-55℃、4-6pa真空度下冻干效果较好。用二水平部分因子设计、登高设计及双因子试验的方法筛选并优化了嗜酸乳杆菌冷冻干燥保护剂。得到嗜酸乳杆菌的最佳冻干保护剂配方为脱脂奶粉100g/L、甘油50mL/L、海藻糖50g/L、抗坏血酸1g/L、氯化钠3g/L、明胶1g/L,冻干存活率高达98%以上,菌粉活菌数高达1.2×1011 cfu/g。将复合抗冷冻因子添加到培养基中培养嗜酸乳杆菌能够提高冻干制备菌粉的存活率。同时研究得到2组复合抗冷冻因子：①甘油4mL/L、海藻糖4g/L、氯化钠4g/L及丙氨酸40mg/L,②肌醇0.1gm、氯化钠3g/L、牛血清蛋白70 mg/L和丙氨酸30m g/L。通过色泽对比发现FD1、FD2与FD3（冷冻干燥制备菌粉的方法）制备出的菌粉色泽较为理想。对比扫描电镜图片发现FD1、FD2与FD3在预冻过程保护剂介质（水）没有形成较大冰晶,菌体与保护剂及介质（水）在冻结时没有发生分离现象。从受控分析发现环境和人为因素对菌粉质量的影响较大,从整体考虑FD1、FD3受控情况优于FD2的。通过菌粉及益生菌羊奶粉贮藏试验发现低温贮藏效果较好。FD1、FD2菌粉贮藏情况优于FD3的；4℃贮藏时FD3益生菌羊奶粉贮藏效果最好。研究得到的嗜酸乳杆菌高密度培养方法能有效降低冻于制备菌粉的成本,制得菌粉活菌数可达到工业生产的要求,复合抗冷冻因子应用技术为提高菌体自身抗冷冻能力奠定了技术支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 嗜酸乳杆菌概述
• 1.2 嗜酸乳杆菌培养研究现状
• 1.2.1 增菌因子
• 1.2.2 增菌培养基及培养条件
• 1.3 冷冻干燥制备高活菌数菌粉考虑的因素
• 1.3.1 菌种内在因素（Intrinsic factors）
• 1.3.2 菌龄
• 1.3.3 菌悬液菌体的浓度
• 1.3.4 培养基的成分
• 1.3.5 抗逆能力
• 1.3.6 保护剂
• 1.3.7 预冻
• 1.4 嗜酸乳杆菌高密度培养及冻干保护剂的研究现状
• 1.5 目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 设备
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 技术路线与试验方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 菌种的活化及培养方法
• 2.2.3 测定方法
• 2.2.3.1 发酵液活菌数与pH及OD值和酸度的测定
• 2.2.3.2 嗜酸乳杆菌生长曲线的测定
• 2.2.3.3 菌粉及益生菌羊奶粉活菌数测定
• 2.2.3.4 菌粉水分的测定方法
• 2.2.4 增菌因子促进嗜酸乳杆菌生长试验
• 2.2.5 高密度培养试验设计
• 2.2.5.1 碳源及氮源的筛选
• 2.2.5.2 培养基成分的优化
• 2.2.5.3 增菌因子试验设计
• 2.2.5.4 细胞循环培养
• 2.2.6 离心收集菌体
• 2.2.7 冷冻干燥试验
• 2.2.7.1 冻干工艺
• 2.2.7.2 培养时间
• 2.2.7.4 静置时间
• 2.2.7.5 预冻温度的选择
• 2.2.8 复合保护剂试验设计
• 2.2.9 抗冷冻因子筛选方法
• 2.2.10 贮藏试验
• 2.2.10.1 菌粉贮藏试验
• 2.2.10.2 益生菌羊奶粉贮藏试验
• 3 结果与讨论
• 3.1 嗜酸乳杆菌生长曲线
• 3.2 嗜酸乳杆菌增菌因子的筛选
• 3.2.1 氨基酸类对嗜酸乳杆菌的促生长作用
• 3.2.2 糖类物质对嗜酸乳杆菌的促生长效果
• 3.2.3 降低培养液氧化还原电位促嗜酸乳杆菌生长的效果
• 3.2.4 天然提取物对嗜酸乳杆菌生长的影响及分析
• 3.2.5 小结
• 3.3 培养基显著成分的筛选及优化分析
• 3.3.1 碳源氮源的确定及效果
• 3.3.2 培养基成分的优化分析
• 3.3.2.1 培养基中嗜酸乳杆菌生长显著因子的筛选
• 3.3.2.2 爬坡试验及结果分析
• 3.3.2.3 Box-Behnken试验设计及响应分析
• 3.3.3 显著增菌因子的筛选及制备
• 3.3.4 小结
• 3.4 培养条件及方式
• 3.4.1 接种量培养温度及时间对嗜酸乳杆菌生长的影响
• 3.4.2 静置与摇床培养对嗜酸乳杆菌生长效果的影响
• 3.4.3 补料方法促嗜酸乳杆菌生长效果分析
• 3.4.4 细胞循环培养影响嗜酸乳杆菌生长效果的分析
• 3.4.5 小结
• 3.5 冻干工艺条件的探讨
• 3.5.1 离心条件对分离菌体效果的影响
• 3.5.2 培养时间对冻干效果影响的分析
• 3.5.3 菌悬液浓度及保护剂添加量对冻干效果的影响
• 3.5.4 装样高度对冻干制备菌粉的影响
• 3.5.5 静置时间影响保护剂功效的分析
• 3.5.6 预冻温度对细胞伤害程度的影响
• 3.5.7 小结
• 3.6 复合保护剂的制备
• 3.6.1 复合保护剂显著因子的筛选
• 3.6.2 爬坡试验及结果
• 3.6.3 双因子试验及结果分析
• 3.6.4 小结
• 3.7 复合抗冷冻因子的制备及影响因素的分析
• 3.7.1 抗冷冻因子的筛选及效果
• 3.7.1.1 氨基酸类对嗜酸乳杆菌冻干的影响
• 3.7.1.2 非氨基酸类对嗜酸乳杆菌生长及冻干的影响
• 3.7.2 复合抗冷冻因子①的制备
• 3.7.3 复合抗冷冻因子②的制备
• 3.7.4 小结
• 3.8 细胞循环培养菌体冻干效果分析
• 3.9 菌粉质量评价
• 3.9.1 菌粉色泽对比
• 3.9.2 菌粉扫描电镜对比分析
• 3.9.3 菌粉产量对比
• 3.9.4 受控分析
• 3.9.5 贮藏过程中活菌数的变化
• 3.9.5.1 菌粉贮藏过程中活菌数的变化
• 3.9.5.2 益生菌羊奶粉贮藏过程中活菌数的变化
• 3.9.6 小结
• 4 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 创新之处
• 4.3 展望
• 4.3.1 高密度培养的展望
• 4.3.2 抗冷冻因子的展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文及专利