论文摘要
口蹄疫（Foot-and-Mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouthdisease virus,FMDV）引起偶蹄动物感染的烈性传染病之一。目前FMD呈世界范围流行趋势,其血清型有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia 1型共7种,其中O型、Asia1型FMD在我国有过报道,特别是近几年来O型、和Asia1型FMD在我国周边国家或东南亚地区时有发生,对我国养殖业构成了严重的威胁。目前用于FMD疫苗研制的重组病毒活载体主要有脊髓灰质炎病毒、牛鼻气管炎病毒、烟草花叶病毒、杆状病毒及鸡痘病毒等。鸡痘病毒转移载体具有其它载体无可比拟的优势,具体表现为:鸡痘病毒基因组结构较为庞大,能容纳较大的外源基因;外源蛋白可被正确地表达,并在感染细胞中得到忠实地修饰,如糖基化、羧基化等;外源基因表达产物具有良好的免疫原性,可诱导机体产生持续时间较长的细胞免疫和体液免疫;严格的胞浆内复制,避免了病毒基因重组入宿主细胞染色体的可能性,消除了重组病毒应用后对人畜的潜在威胁。本研究所使用的鸡痘病毒转移载体是以人工合成的串联的痘苗病毒突变型p7.5启动子以及由牛痘病毒A型包涵体（ATI）启动子构成的复合启动子作为启动外源基因的启动子,可以大大提高外源基因的表达量。本研究从含有口蹄疫病毒（FMDV）的牛水疱液中提取总RNA,采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增Asia-I/JL株FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因及蛋白酶3C基因,并将其克隆到pMD18-T载体,通过对重组质粒的酶切鉴定,成功克隆了FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,其大小分别为2223bp和639bp,并构建了DNA重组质粒T-P1-2A-3C,经酶切获得Asia-Ⅰ型P1-2A-3C基因。以军事兽医研究所张洪勇博士构建的O型FMDV克隆质粒T-P1-2A、质粒pUMT-IL18为基础,构建了DNA重组质粒T-P1-2A-IL18,经酶切获得O型口蹄疫病毒P1-2A-IL18基因。将酶切得到FMDV Asia-Ⅰ型P1-2A-3C基因与FMDV O型P1-2A-IL18基因克隆至鸡痘病毒表达载体质粒pUTAL上,构建重组鸡痘病毒转移载体质粒vUTAL-P1-2A-IL-18-P1-2A-3C。通过脂质体转染法,将vUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL18与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,通过Brdu三次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株,经RT-PCR和间接免疫荧光法检测,筛选出1株重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-IL-18-P1-2A-3C基因盒。成功获得了一株共表达O型和Asia-Ⅰ型口蹄疫