论文摘要
近几十年来,密集型鲤鱼养殖在中国已成为一个关键的行业。如果在养殖过程中，水体被气单胞菌属感染,鲤鱼将会大量死亡，造成巨大的经济损失，因此有必要对鲤鱼进行保护性免疫处理。目前，人类已经发展了许多技术来提高口服疫苗传输，纳米颗粒因其可以有效的防止活性物质降解、提高药物的跨膜转运及可控释放等优点而备受人们关注。此外，纳米材料的黏膜粘附性在其作为口服疫苗输送系统的方面也尤为重要。材料的黏膜粘附性可以延长药物载体在胃肠道的滞留时间，增加药物与黏膜层的接触机会，从而提高药物渗透率，并且减少药物的降解。对壳聚糖进行双亲性修饰，制备中性条件下可溶的油酰羧甲基壳聚糖（OCMCS）。红外、核磁检测证实了油酰基和羧甲基侧链成功连接在壳聚糖上，元素分析结果表明油酰基侧链及羧甲基侧链的取代度分别约为5%和70%，通过芘荧光探针法测定OCMCS的临界聚集浓度为0.021mg/ml，说明在高于此浓度下，OCMCS溶液中有稳定的疏水微区形成。以FITC为荧光标记，共价修饰OCMCS主链上（FITC-OCMCS），可以对该载体材料定位示踪。采用胶质凝聚法制备三种不同分子量的OCMCS纳米颗粒，平均粒径是150–350nm，zeta电位是10-20mV，透射电镜观察纳米粒均为完整的球形。红细胞溶血实验表明，OCMCS纳米颗粒的溶血率很低，符合生物医用材料对溶血率的要求。MTT实验结果表明纳米材料没有明显的细胞毒性，体内的毒性试验表明，纳米材料不会引起明显的组织学病变。以上结果表明，OCMCS纳米颗粒可以作为一种安全的口服药物运输载体。以FD4为荧光标记，同时作为一种大分子药物模型，制备FD4-OCMCS纳米颗粒。FD4-OCMCS纳米颗粒可以有效的吸附于离体鲤鱼肠粘膜表面，吸附量随壳聚糖分子量的增加而增加。与FD4溶液相比，OCMCS纳米颗粒将FD4跨肠粘膜转运的效率提高到3.26-6.52倍，OCMCS纳米颗粒与Caco-2细胞致密单层相互作用，降低细胞单层的跨膜电阻，并且将FD4的表观渗透系数提高了3.61-6.32倍。FITC-OCMCS纳米颗粒对鲤鱼进行口服给药，3天后，在鲤鱼的肌肉、心脏、肾脏、肝脏、肠及脾脏等组织中均可检测到荧光纳米颗粒，对各组织中的荧光纳米颗粒进行定量分析，结果显示，肝脏、肾脏及脾脏中的荧光纳米颗粒的量分别为34.32%、18.79%和17.36%。其中肝脏中荧光纳米颗粒的量最低。维氏气单胞菌的细胞外产物（ECPs）气溶素作为细菌抗原被有效包载制备OCMCS-ECPs纳米颗粒,OCMCS-ECPs纳米颗粒在PBS中稳定可以稳定的释放其包载的ECPs。选择OCMCS-ECPs纳米颗粒和ECPs溶液分别对鲤鱼进行口服免疫，免疫3次后，用OCMCS-ECPs处理的鲤鱼血清中可以检测到显著增强的特异性抗体。在OCMCS纳米颗粒中引入透明质酸（HA）制备基因纳米载体（OCMCS-HA/DNA），对纳米颗粒的制备条件进行了优化，结果发现，在N/P为5，OCMCS/HA（w/w）为4时，可以制备获得颗粒最小，表面带正电荷，颗粒形状均一的纳米颗粒。由于HA的引入，OCMCS-HA/DNA纳米颗粒表现出更高的DNA释放量，并且更有利于被Caco-2细胞吞噬。OCMCS-HA/DNA纳米颗粒对于绿色荧光蛋白基因的细胞转染率是OCMCS/DNA的5倍，加入游离的HA后，OCMCS-HA/DNA纳米颗粒的转染效率明显下降。结果表明，OCMCS-HA/DNA纳米颗粒的细胞吞噬是由Caco-2细胞表面的CD44受体介导。将气溶素的编码基因aerA载入OCMCS-HA纳米颗粒，凝胶电泳实验表明纳米颗粒可以有效地吸附包裹DNA，通过双敏切实验验证了被包裹DNA的稳定性和完整性。利用透析法研究了OCMCS-HA/aerA、OCMCS/aerA两种纳米粒对于DNA的释放效果，在pH6.0缓冲溶液中，两种纳米粒对DNA的释放都比较缓慢，20h内OCMCS-HA/aerA和OCMCS/aerA的累积释药量分别为12.4%和10.2%；当改变释药介质的pH至7.4后，原本达到释药平衡的纳米粒又在10小时内出现明显的突释现象，在随后的20h继续缓释，50h内OCMCS-HA/aerA和OCMCS/aerA的累积释药量分别为77.4%和31.4%，结果表明两种纳米颗粒都适合在肠道的中性pH下释放DNA，并且OCMCS-HA/aerA纳米颗粒有较高的释放量。本论文在壳聚糖的基础上，双亲性修饰得到一种水溶性的油酰羧甲基壳聚糖来制备口服疫苗载体，通过体外、体内实验评价了该载体材料的黏膜粘附性，通透性及生物安全性，通过对蛋白类疫苗和基因疫苗的有效包载，成功对鲤鱼进行了保护性的口服免疫，结果证明，该纳米材料有望成为一种安全有效的口服疫苗运送载体。