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口蹄疫病毒vp2基因的克隆表达及抗体检测方法的建立

2020-12-01阅读(169)

口蹄疫病毒vp2基因的克隆表达及抗体检测方法的建立

论文摘要

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouthdisease virus,FMDV）引起的急性热性高度接触性传染病,主要侵害偶蹄动物,偶见于人和其它动物。现今发达国家往往通过捕杀感染动物、同居动物及可疑畜群来控制和消灭本病。而发展中国家多采用注射疫苗的方法以控制该病的发生和流行。我国主要通过注射疫苗来预防和控制口蹄疫,因此免疫后快速方便的抗体水平检测显得尤为重要。目前,国外学者研究表明VP2蛋白具有免疫原性,动物体内的FMDV抗体均可与VP2蛋白发生特异性反应。另外,口蹄疫病毒四种结构蛋白的遗传变异顺序依次是:VP1＞VP3＞VP2＞VP4,VP1变异性最大,VP4位于病毒衣壳的内部对免疫贡献相对较少,动物机体很少产生针对VP4蛋白的抗体。相比之下VP2基因相对保守,以VP2蛋白作为抗原检测动物体内口蹄疫抗体有其自身的优点。单克隆抗体因具有高度均质性和特异性的特点,在生物医学领域得到广泛的应用。本研究分别克隆和表达了O型及亚洲I型口蹄疫病毒VP2基因,建立了针对这两种病毒抗体的ELISA方法,同时制备了亚洲I型口蹄疫VP2蛋白的单克隆抗体,建立了FMDV VP2结构蛋白竞争ELISA抗体检测方法,经临床试验证明该方法有较高的灵敏度和特异性。具体研究内容如下:1.克隆表达O型和亚洲I型口蹄疫病毒VP2基因根据GenBank公布的序列,分别设计合成了AsiaI型和O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP2引物。PCR扩增得到了AsiaI型口蹄疫病毒VP2片段大约693bp,O型的VP2片段大约660bp序列分析表明是VP2基因,将两种VP2基因亚克隆至表达载体,实现目的基因的原核表达。2.O型和AsiaI型口蹄疫病毒抗体间接ELISA方法的建立以纯化的原核表达O型或AsiaI型口蹄疫病毒VP2蛋白包被酶标板,分别建立了O型和AsiaI型口蹄疫病毒抗体间接ELISA方法。对影响ELISA反应条件的各种因素进行了优化和选择,如蛋白的包被浓度、温度及时间,各步骤反应的温度及时间,封闭液的选择及浓度确定等,使得该方法有较好的稳定性和重复性。3.Asial型口蹄疫病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备以纯化的VP2蛋白免疫Balb/C小鼠,将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA方法筛选,采用有限稀释法对其进行克隆,经过3次融合共获得2株能稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F12,5F5。两株单抗的腹水效价分别为29×100,212×100且单克隆抗体特异性良好,与载体蛋白无交叉反应。4.Asial型口蹄疫病毒竞争ELISA方法的建立及初步应用以VP2蛋白为抗原,以辣根过氧化物酶标记的单抗5F5为第二抗体,建立了快速检测FMD抗体的竞争ELISA方法,对于影响ELISA的各种因素进行了优化和选择,包括蛋白的包被浓度、温度及时间,各步反应的温度及时间,封闭液的选择及浓度确定等,使得试剂盒具有较好的稳定性和重复性,具有较好的临床应用价值。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表（ABBREVIATION）
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 口蹄疫的流行及其危害
  • 1.2 口蹄疫病毒的抗原性与变异性
  • 1.3 结构蛋白基因
  • 1.3.1 非结构蛋白基因
  • 1.4 口蹄疫的防制
  • 1.4.1 干扰素（interferon）的应用
  • 1.4.2 反义技术的应用
  • 1.4.3 RNA干扰技术的应用
  • 1.5 口蹄疫诊断技术研究进展
  • 1.5.1 病原学诊断
  • 1.5.2 抗体检测
  • 1.6 单克隆抗体在口蹄疫病毒研究中的应用
  • 1.6.1 单抗在FMDV中和抗原的分析与定位中的应用
  • 1.6.2 单抗在口蹄疫诊断和检疫中的应用
  • 第2章 本研究的目的和意义
  • 第3章 材料与方法
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 试验材料
  • 3.1.2 酶类及试剂盒
  • 3.1.3 主要溶液和试剂
  • 3.1.4 培养基
  • 3.1.5 ELISA相关溶液
  • 3.1.6 单抗制备相关溶液
  • 3.2 实验方法
  • 2基因克隆表达'>3.2.1 O型和亚洲I型口蹄疫VP2基因克隆表达
  • 2蛋白间接ELISA方法的建立'>3.2.2 O型和AsiaI型口蹄疫病毒VP2蛋白间接ELISA方法的建立
  • 3.2.3 AsiaI型口蹄疫病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
  • 3.2.4 AsiaI型口蹄疫病毒VP2蛋白单抗竞争ELISA方法的建立
  • 第4章 结果与分析
  • 2基因的克隆表达'>4.1 ASIA I和O型口蹄疫病毒VP2基因的克隆表达
  • 2蛋白间接ELISA方法的建立'>4.2 O型和ASIA I型口蹄疫病毒VP2蛋白间接ELISA方法的建立
  • 4.2.1 最佳包被浓度的确定（方正滴定）
  • 4.2.2 阴阳界限的确定
  • 4.2.3 O型和AsiaI型口蹄疫病毒VP2间接ELISA反应条件的优化
  • 4.2.4 特异性和敏感性实验
  • 4.2.5 重复性试验结果
  • 4.2.6 抗体检测
  • 2蛋白单克隆抗体的制备'>4.3 ASIAI型口蹄疫病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备
  • 4.3.1 单克隆抗体细胞株筛选
  • 4.3.2 细胞融合后结果观察
  • 4.3.3 westeron-blot鉴定
  • 4.3.4 染色体计数结果
  • 4.3.5 单克隆抗体效价测定
  • 4.3.6 单抗亚类鉴定结果
  • 4.3.7 稳定性检测
  • 4.3.8 单抗5F5的提纯
  • 2蛋白竞争ELISA方法的建立'>4.4 ASIAI型口蹄疫病毒VP2蛋白竞争ELISA方法的建立
  • 4.4.1 酶标抗体的建立及效价的测定
  • 4.4.2 VP2蛋白包被浓度与酶标单抗浓度的确定
  • 4.4.3 阴阳界限的确定
  • 2蛋白竞争ELISA方法条件的优化'>4.4.4 AsiaI型口蹄疫VP2蛋白竞争ELISA方法条件的优化
  • 4.4.5 特异性和敏感性实验
  • 4.4.6 重复性试验结果
  • 4.4.7 抗体检测
  • 第5章 讨论
  • 2蛋白'>口蹄疫VP2蛋白
  • 单克隆抗体的制备
  • 间接ELISA方法的建立
  • 2蛋白竞争ELISA方法的建立'>AsiaI型口蹄疫病毒VP2蛋白竞争ELISA方法的建立
  • 第6章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

    • 相关论文文献

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