RNA干扰抑制COX-2合成以及对类风湿关节炎滑成纤维细胞生物学活性的影响研究

论文摘要

RNA干扰抑制COX-2合成以及对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞生物学活性的影响研究立题依据类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA，简称类风关）是常见的、慢性致残性自身免疫性疾病之一。疾病的病因目前尚不清楚，可能的起始因子触发了炎症反应，促使膜磷脂分解为花生四烯酸，在环氧化酶（cyclooxygenase，COX）等一系列酶的催化作用下，合成前炎症介质前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和细胞因子如白介素-1β（interleukin-1，IL-1）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumorous necrosis factor-α，TNF-α）等，后者通过多种途径促进关节炎症持续进展和关节的破坏。COX是花生四烯酸转化为前列腺素过程中的限速酶，有研究证实类风关患者滑膜组织COX-2表达显著增加，它的活性高低直接关系到组织中前列腺素合成的量，在关节炎症中最为重要的是PGE2。PGE2具有多种生物学功能，参与促进关节炎症反应，增加了MMP（matrix metalloproteinase，基质金属蛋白酶）的合成和诱导软骨的降解。COX-2和PGE2在促进VEGF生成和关节滑膜新生血管形成中起着关键的作用。因此，本研究试图寻找有效的小分子干扰RNA（siRNA，small interfering RNA）应用RNA干扰技术（RNAi，RNA interfering）来特异性地抑制人类风关滑膜成纤维细胞COX-2（hCOX-2，human COX-2）基因的表达，同时在细胞水平探讨hCOX-2基因的生物学功能，初步探讨抑制类风关炎症进展和关节破坏的新途径。主要研究目的筛选和体外合成hCOX-2 siRNA，并转染入人类风关滑膜成纤维细胞，旨在筛选出并合成能够特异性阻断人类风关滑膜成纤维细胞hCOX-2生成的siRNA。次要研究目的进一步分析特异性地阻断人类风关滑膜成纤维细胞hCOX-2合成的siRNA对前炎症介质PGE2和致炎症性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α合成的作用，了解其对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）合成的影响；观察hCOX-2 siRNA对人类风关滑膜成纤维细胞生长的影响。研究方法实验的滑膜组织取之于行滑膜切除术的类风关患者（符合1987年美国风湿病协会修订的类风关诊断标准）。通过分离、消化、培养和传代滑膜成纤维细胞，液氮冻存。获取人COX-2 mRNA序列，设计和合成4条针对COX-2 mRNA siRNA（1#—4#siRNA），1条随机序列作为对照。分成A-H组，A组为未转染阴性对照；B—F组处理依次为随机siRNA（NC）、1#siRNA、2#siRNA、3#siRNA、4#siRNA，G-H组为NS-398（COX-2选择性抑制剂）浓度100μmol/L和浓度500μmol/L处理。另设立Hela细胞为阳性对照。将复苏后的人类风关滑膜成纤维细胞滴加于6孔板中，应用LipofectAMINE2000转染，4小时后，各培养孔加入终浓度为200nmol/L的佛波酯（PMA）。分别在转染36h和48h后收集滑膜细胞，提取蛋白质和总RNA，应用半定量的RT-PCR检测hCOX-2 mRNA表达水平，通过Western Blot检测hCOX-2蛋白表达水平。应用ELISA方法检测hCOX-2下游产物PGE2的水平。应用ELISA方法检测成纤维细胞培养上清液细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。检测成纤维细胞培养上清液VEGF水平。比较COX-2表达水平和细胞因子水平之间相关性。观察各组成纤维细胞形态和通过台盼蓝染色检测细胞死亡数目。采用χ2检验比较未处理阴性对照组（CTL）与不同处理组之间以及不同处理组之间细胞死亡率在统计学上有无差别。结果（1） RT-PCR检测各组人滑膜成纤维细胞hCOX-2 mRNA水平：转染48h后，与未转染对照组（CTL）、随机序列对照组（NC）、阳性对照Hela细胞组条带相比，4#siRNA有明显的抑制效果。通过应用GelWork软件对各组凝胶密度扫描，在内参照丰度基本相等的前提下，以CTL组为对照，NC、1#siRNA、2#RNA、3#RNA、4#siRN、阳性对照Hela细胞组与CTL组条带密度比值分别为0.72、0.3、0.25、0.4、0.04、2.1。NC、1#siRNA、2#RNA、3#RNA、4#siRN、100μmol/L NS398、500μmol/L NS398各组与CTL组hCOX-2mRNA条带密度比值分别为0.71、0.19、0.16、0.25、0.04、2.05和0.63，提示4#siRNA干扰COX-2mRNA表达的效率明显高于阴性对照组、其他siRNA组，也优于100μmol/L NS398和500μmol/L NS398。（2） Western检测各组人滑膜成纤维细胞hCOX-2蛋白表达的水平：转染36h后，与未转染对照组（CTL）、随机序列对照组（NC）、阳性对照Hela细胞组相比，1#siRNA、2#siRNA、3#siRNA组无明显的抑制效果，4#siRNA组抑制效果明显。采用GelWork软件对各组条带行凝胶密度扫描，在内参照Actin mRNA丰度基本相等的前提下，NC、1#siRNA、2#RNA、3#RNA、4#siRN、Hela细胞组与CTL组hCOX-2蛋白密度比值分别为1.04、0.52、0.39、0.9、0和2.48，提示4#siRNA干扰COX-2蛋白表达效率明显优于未处理组和其他siRNA组；转染48h后，4#siRNA组条带明显较其他组条带色淡，NC、1#siRNA、2#RNA、3#RNA、4#siRN、Hela细胞组与CTL组hCOX-2蛋白条带密度比值分别为1.05、0.52、0.51、0.9、0.15，此结果与PCR一致。提示4#siRNA能显著抑制人类风关滑膜成纤维细胞hCOX-2蛋白表达。（3）人滑膜成纤维细胞培养上清液PGE2水平的测定：在转染后24h、36h和48h，4#siRNA组滑膜成纤维细胞培养上清液PGE2水平均较其他各组为低，且在转染后第24h至36h之间下降幅度最为明显。4#siRNA组在转染24h、36h、48h后也较100μmol/LNS398组水平低，与500μmol/L NS398组水平相近。（4）人滑膜成纤维细胞培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF水平的测定：4#siRNA组致炎症细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和VEGF下降水平较CTL、随机序列对照组、其他siRNA组为低；与100μmol/L NS398组比较，在24h、36h下降显著，与500μmol/LNS398组趋势相类似和水平相接近，但在48h时略高于500μmol/L NS398组。（5） siRNA对人类风关滑膜成纤维细胞hCOX-2 mRNA表达与培养上清液PGE2、IL-1β、TNF-α、VEGF水平相关性影响：在转染24h时，TNF-α水平和hCOX-2表达无相关性外，不同siRNA处理组分别在24h、36h、48h时，随着COX-2 mRNA表达水平下降，滑膜成纤维细胞培养上清液PGE2、IL-1β、TNF-α、VEGF水平也随之明显下降。提示siRNA不同处理组COX-2mRNA表达水平分别与PGE2、IL-1β、TNF-α、VEGF水平呈平行关系。（6）干扰COX-2表达后对人类风关滑膜成纤维细胞生长影响：不同siRNA处理组成纤维细胞死亡率在9％～11％，各组与CTL组相比死亡细胞数在统计学上无明显差别（P值均大于0.05）。4#siRNA组与其他siRNA处理组在死亡细胞数在统计学上无明显差别（P值均大于0.05）。与500μmol/LNS398组比较，4#siRNA组细胞死亡率与之相近（11％），在统计学上无明显差别（P值均大于0.05）。各组在外观形态学上无明显差别，提示RNAi对人滑膜成纤维细胞毒性没有明显增加，4#siRNA较其他siRNA有效地抑制hCOX-2表达的同时，其成纤维细胞死亡细胞数并未较其他组增加。结论4#siRNA（针对COX-2 mRNA靶序列CGTTCGACTGAACTGTAGA）能有效地抑制人类风关滑膜成纤维细胞COX-2mRNA表达和COX-2蛋白的合成，且同时抑制其合成PGE2和炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及VEGF，siRNA不同处理组COX-2 mRNA表达水平与IL-6水平呈平行关系。siRNA干扰COX-2合成后对人类风关滑膜成纤维细胞生长无影响。

论文目录

• 全文英文缩写索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、疾病状况
• 二、研究技术
• 第一部分 人类风关滑膜成纤维细胞制备和COX-2 siRNA合成、转染及筛选
• 一、人类类风湿关节炎滑膜成纤维细胞培养
• 二、COX-2 mRNA RNAi靶点设计
• 三、人类风关滑膜成纤维细胞复苏和分组
• 四、人类风关滑膜成纤维细胞转染siRNA
• 五、RT-PCR检测人类风关滑膜成纤维细胞hCOX-2的mRNA表达水平
• 六、Western Blot检测人类风关滑膜成纤维细胞hCOX-2蛋白表达水平
• 七、结果
• 八、讨论
• 九、结论
• 第二部分 hCOX-2 siRNA对人类风关滑膜成纤维细胞培养上清液中PGE2、IL-1、IL-6、TNF和VEGF影响
• 一、人类风关滑膜成纤维细胞培养上清液PGE2水平测定
• 二、人类风关滑膜成纤维细胞培养上清液致炎症细胞因子测定
• 三、人类风关滑膜成纤维细胞培养上清液VEGF定量测定:
• 四、siRNA对COX-2 mRNA表达与PGE2、IL-1β、TNF-α、VEGF水平相关性影响
• 五、讨论
• 六、结论
• 第三部分 干扰COX-2表达后对人滑膜成纤维细胞生长影响
• 一、台盼蓝染色检测细胞死亡数目
• 二、人类风关滑膜成纤维细胞各实验组形态学观察:
• 三、讨论
• 四、结论
• 结论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 综述
• 致谢
• 在研究生期间发表文章