斑点酶免疫渗滤法检测纳米细菌致兔胆结石血清学方法的建立

论文摘要

纳米细菌（Nanobacteria,Nb）是由芬兰科学家Kajander于1989年发现的一种超微细菌,它们呈球形或杆状,具有细胞壁,直径在80～500nm之间,菌落常呈蔟状;能生成含有磷灰石的生物膜,具有很强的抗热、抗γ射线辐射及抵御抗生素的能力;能通过100nm的滤菌器,且具独特的生物矿化能力。近年来,有研究资料表明,纳米细菌与胆囊结石、肾结石、动脉粥样硬化等多种骨骼外钙化性或硬化性疾病有关,引起了科学界极大的关注。采用抗纳米细菌单克隆抗体作免疫荧光及免疫组化检测,扫描电镜、透射电镜及免疫电镜等形态学观察,是目前鉴定纳米细菌的主要方法。目的本研究旨在通过对胆石症患者胆汁纳米细菌分离培养,免疫动物,制备多克隆抗体;并对试验条件的探讨优选,建立斑点酶免疫渗滤法检测动物血清中特异性纳米细菌抗体的初步诊断方法。方法1.选择无急性胆囊炎发作病史,腹腔镜手术前未接受抗生素治疗的6例胆囊结石患者,无菌操作抽取胆汁进行纳米细菌培养,同时设DMEM全培养液培养和合成羟基磷灰石培养为阴性对照。2.用数显浊度仪测量胆石症患者胆汁分离培养物和对照组中纳米细菌生长情况并绘制生长曲线。3.用扫描电镜对胆石症患者胆汁分离培养物进行能谱分析,并用透射电镜对纳米细菌培养物进行形态学观察。4.用纳米细菌培养物制成纳米细菌滴片,分别按文献方法进行间接免疫荧光染色、Von KOSSA染色及Hochest 33258染色。5.纯化抗原,通过考马斯亮蓝定量蛋白浓度为174.2μg/ml,保存备用。6.免疫家兔免疫家兔3只,背部多点接种含福氏完全佐剂的纳米细菌（总量200μg/ml/只）。2周后接种含福氏不完全佐剂的纳米细菌（总量50μg/ml/只）进行加强免疫（每次间隔2周,共4次）,制备纳米细菌多克隆抗体,并用ELISA测定其含量。7.建立纳米细菌多克隆抗体斑点酶免疫渗滤检测法将兔抗纳米细菌多克隆抗体用二倍顺序稀释法稀释至1:6400～1:51200;纳米细菌抗原稀释至1?10～1:160等不同浓度;通用型抗鼠/兔酶标抗体稀释至1:10～1:40。用方阵滴定法确定所有试验点及其相应的抗原抗体反应浓度。每个试验点重复6次,以出现肉眼能判读的棕色斑点或圆圈者为阳性,不能判读者为阴性。对每个阳性反应棕色斑点,用“Motic Med 6.0数码医学图象分析系统（A）”读取光密度值（OD值）,求出每个试验点的平均OD值。分析数据,选择检测纳米细菌多抗的最佳兔抗纳米细菌抗原滴度和酶标抗体滴度的反应组合。抗原和酶标抗体滴度固定后,进一步检测不同稀释度的多克隆抗体,读取数据,分析OD值变化与纳米细菌多抗含量的关系,绘制标准曲线,求出回归方程及相关系数。8.斑点酶免疫渗滤法的特异性检测及评价用最佳纳米细菌抗原滴度和酶标抗体滴度的反应组合,以斑点酶免疫渗滤法对不同浓度的实验动物感染阳性血清标本和阴性血清标本进行检测,通过诊断灵敏度、诊断特异性和假阳性率等指标确定样本的最佳稀释浓度。用最佳纳米细菌抗原滴度和酶标抗体滴度的反应组合,对纳米细菌感染实验各组家兔血清标本进行检测,并评价其诊断灵敏度、诊断特异度、阳性结果预期值、阴性结果预期值及总有效率。结果1. 6例胆石症患者胆汁样本在含有10%γ-FBS的DMEM、37℃和5%CO2培养条件下,纳米细菌培养均为阳性。2.胆石症患者胆汁培养物在倒置相差显微镜下可见做布朗运动的微小的颗粒。培养过程中纳米细菌缓慢生长,培养液的pH值无明显变化;传代后的纳米细菌仍维持上述生物学特性。3.经数显浊度仪测量,在4周内,每5天测量一次,纳米细菌培养组浊度一直呈上升趋势,其倍增时间约为3天,而DMEM和羟基磷灰石对照组无明显变化,经180℃干烤4h灭活的纳米细菌培养组也未见明显变化。4.纳米细菌的鉴定透射电镜下观察,纳米细菌约为80～350nm,呈椭球形或短棒状颗粒,聚集成簇状,其表面覆有细菌被膜。扫描电镜能谱分析（EDX）显示,纳米细菌含有钙、磷、铝、硅、硫等元素,其钙/磷比值为1.62,与羟基磷灰石中钙/磷比值的1.66相近。Von KOSSA钙染色法结果显示纳米细菌形成的矿化外壳呈黑色。间接免疫荧光染色显示纳米细菌被荧光抗体结合,在荧光显微镜下激发绿色荧光。纳米细菌可被Hoechst 33258染色,发出特征性的蓝色荧光,提示纳米细菌含有DNA成分。5.免疫家兔血清经ELISA检测,多抗的浓度为56.25mg/ml。6.斑点酶免疫渗滤法检测Nb多克隆抗体的最佳反应滴度为:Nb抗原1:20（8.71μg/ml）,通用型酶标抗体浓度1:10。建立不同稀释浓度的多抗与OD值变化关系的标准曲线,求出回归方程Y=0.0832X+0.0745,相关系数r=0.876（P<0.05）。确定最小Nb多克隆抗体稀释比例为1:12800,最小抗体检出浓度为68.59ng/ml。7.用最佳纳米细菌抗原滴度和酶标抗体滴度的反应组合,以斑点酶免疫渗滤法对不同浓度的实验动物感染阳性血清标本和阴性血清标本进行检测,确定最佳血清样本工作滴度为1:6400。8.用斑点酶免疫渗滤法检测对纳米细菌感染实验各组家兔血清标本进行检测的结果:40份阳性,56份阴性;而芬兰nanobac公司ELISA试剂盒检测结果为:38份阳性,58份阴性。检测结果经配对资料χ2检验,与纳米细菌感染家兔致胆结石结果相关（χ2=88.055, P=0.001）,且两者具有高度诊断一致性（kappa值为0.957）。结论1.患有胆囊结石的患者胆汁中存在纳米细菌感染。纳米细菌体积微小,生长缓慢,在生理条件下其菌体表面可生成羟基磷灰石矿化外壳。2.纳米细菌具有免疫原性,可以通过免疫动物制备抗血清。3.初步建立斑点酶免疫渗滤法对兔血清中纳米细菌抗体检测法,其灵敏度:96.55%;特异度:82.09%;约登指数:0.7867;总有效率:86.46%;阳性预期值:70.00%;阴性预期值:98.21%。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 第一部分 纳米细菌的培养与检测
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 免疫斑点法检测纳米细菌感染动物血清的初步应用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 需要进一步解决探讨的问题
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历