论文摘要
端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的DNA-蛋白质复合体结构,有维持染色体稳定和基因组完整的功能,随细胞的分裂不断缩短,直至染色体丢失、融合、重组和降解,发生细胞凋亡,因而被称为细胞分裂的“生物钟”。端粒酶是一种逆转录酶,能以自身的RNA为模板合成端粒的DNA重复序列（5-TTAGGG-3）n加在染色体末端,维持端粒长度,使细胞发生永生化或变成癌细胞。端粒酶在85%以上的恶性肿瘤组织中阳性表达,而在正常体细胞中则一般为阴性。把端粒酶作为肿瘤治疗的靶点具有良好的应用前景。目前研究认为人端粒酶复合体主要由人端粒酶RNA（human telomerase RNA,hTR）和人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）组成。最近研究报道hTERT既是影响端粒酶活性的最重要部分,也是端粒酶活性的限速因子。因此,靶向hTERT显然更为理想。其中重要的方法有反义核酸技术封闭、锤头状核酶切割和抑制hTERT的转录等。RNA干扰（ RNA interference,RNAi ）是指由特定双链RNA （double-stranded RNA ,dsRNA）引起的转录后基因沉默现象。研究表明,Dicer核酸酶（Dicer RNase L）断裂dsRNA产生的小干涉RNA可以抑制哺乳动物体细胞和胚胎中的基因的表达。RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase ,RdRP）在扩增RNAi中起着关键性的作用,RdRP活性复制较长触发性dsRNA或以一种非引物的方式复制小干扰RNA（small interfering RNA ,siRNA ）,即以siRNA为引物的RdRP反应使靶mRNA转变为dsRNA,同时复制触发性dsRNA。所有的产物又可作为Dicer的底物,起始RdRP级联反应。目的:研究载体介导RNAi技术对食管癌细胞系ECA109端粒酶及hTERT mRNA表达的抑制作用,探讨RNAi抑制肿瘤细胞的作用及机理。方法:根据Gene bank中报道的hTERT的核苷酸序列,参考siRNA的设计策略,通过基因blast,挑选3条目的hTERT基因的siRNA序列:Ⅰ:T T G C A A A G C A T T G G A A T C A,Ⅱ:A G A A C G T T C C G C A G A G A A,Ⅲ:G T A C A G G T T T C A C G C A T G T,构建干扰质粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及空质粒,并将其分别转染食管癌细胞系ECA109,荧光显微镜观察转染效果;24h、48h末端重复片断扩增-酶联免疫吸附（TRAP-ELISA）方法测定细胞端粒酶活性,筛选出高效抑制端粒酶活性的hTERT siRNA,RT-PCR观察ECA109细胞中hTERT mRNA表达改变。结果:1重组质粒和空质粒酶切鉴定:经BamH I和HindⅢ酶切后干扰质粒插入片段为110bp左右,空质粒插入片段为70bp左右。2质粒转染细胞24h、48h后荧光显微镜观察各转染组均见有绿色荧光的细胞,约占细胞总数的50%-60%。3端粒酶活性测定:干扰质粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及空质粒转染ECA109细胞后端粒酶活性数值:24h端粒酶活性均数依次为:0.417±0.023,0.189±0.025,0.435±0.034与对照组均数0.879±0.036比较,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有显著性差异（P<0.05）。48h端粒酶活性均数依次为:0.435±0.032,0.177±0.020,0.395±0.021与对照组均数0.847±0.027比较,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均有显著性差异（P<0.05）。各干扰质粒的抑制率:48h各干扰质粒的抑制率:干扰组Ⅰ抑制率= 49%,干扰组Ⅱ抑制率=79%,干扰组Ⅲ抑制率=53%,Ⅱ组抑制率最高。4半定量RT-PCR结果4.1 RNA电泳结果:显示18s,28s条带完整、清晰,28s带的宽度及亮度约是18s的2倍左右。4.2 hTERT和β-actin的扩增基因经电泳,结果显示扩增片段大小与所设计的大小完全一致,分别为198 bp和621bp,重组质粒Ⅱ转染的ECA109中hTERT-mRNA的表达较空质粒转染的ECA109中hTERT-mRNA表达量显著下降,hTERT扩增产物强度与内对照β-actin的比值在对照组和实验组分别为0.9323±0.0155,0.5167±0.01922,有显著性差异（P<0.01,n=4）。实验组降低为对照组的55.4%。结论:成功构建载体介导的hTERT靶向RNA干扰重组体,能有效抑制食管癌细胞系ECA109端粒酶活性及hTERT-mRNA表达,确定特异性抑制端粒酶活性的siRNA靶点,为进一步开发抗肿瘤新药和基因治疗提供试验和理论依据。
论文目录
相关论文文献
- [1].组蛋白去乙酰化酶抑制剂对食管癌细胞抗肿瘤活性及其相关机制的研究进展[J]. 东南国防医药 2018(04)
- [2].N-乙酰转移酶影响食管癌细胞生物学功能的研究[J]. 福建医药杂志 2017(04)
- [3].更正[J]. 中国癌症防治杂志 2011(03)
- [4].放疗分割剂量对食管癌细胞耐药基因表达的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2010(02)
- [5].激活转录因子3的过表达对食管癌细胞生长的抑制作用[J]. 癌变.畸变.突变 2009(04)
- [6].成纤维细胞生长因子结合蛋白2过表达促进食管癌细胞的增殖[J]. 癌变·畸变·突变 2019(03)
- [7].用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的单链抗体[J]. 现代肿瘤医学 2017(10)
- [8].辛伐他汀对食管癌细胞放疗敏感性的影响[J]. 西安交通大学学报(医学版) 2016(04)
- [9].丹皮酚对食管癌细胞放射增敏作用及其机制[J]. 蚌埠医学院学报 2020(01)
- [10].食管癌肿瘤标志物在食管癌细胞中的表达及临床意义[J]. 中国卫生工程学 2017(03)
- [11].雷公藤红素抑制食管癌细胞转移及其机制[J]. 生理学报 2015(03)
- [12].食管癌细胞来源的外泌体对肿瘤细胞迁移及侵袭能力的影响及机制研究[J]. 解放军医学杂志 2017(04)
- [13].叶酸受体在食管癌细胞中的表达及其与食管癌生物学行为的关系[J]. 中国现代药物应用 2013(12)
- [14].启膈散对食管癌细胞间同质黏附力的影响[J]. 中国全科医学 2016(27)
- [15].磷酸化小窝蛋白-1在食管癌细胞中的表达及意义[J]. 中国临床研究 2015(10)
- [16].表没食子儿茶素没食子酸酯对体外培养食管癌细胞生物学行为的影响[J]. 时珍国医国药 2014(05)
- [17].表没食子儿茶素没食子酸酯对食管癌细胞生长的抑制作用及机制研究[J]. 解放军医学杂志 2014(09)
- [18].乙酰胆碱与去甲肾上腺素对食管癌细胞分化调节作用及其机制的研究[J]. 中华肿瘤防治杂志 2008(01)
- [19].小窝蛋白-1与食管癌细胞迁移之间的关系[J]. 中国临床研究 2015(08)
- [20].通道化噎丸对食管癌细胞端粒酶活性的影响[J]. 中国医药导报 2009(29)
- [21].枸杞多糖对实验性食管癌大鼠食管癌细胞的生长抑制作用[J]. 职业与健康 2010(22)
- [22].抗失巢凋亡促进食管癌细胞肺转移[J]. 肿瘤防治研究 2009(06)
- [23].食管癌细胞对肿瘤化疗药物体外敏感性的测定[J]. 中国药师 2008(07)
- [24].放射抗拒食管癌细胞系的建立及抗拒机制研究[J]. 中国肿瘤 2009(11)
- [25].咖喱有助杀死食管癌细胞[J]. 恋爱婚姻家庭(养生) 2010(01)
- [26].慢病毒介导沉默食管癌细胞53BP1基因表达对裸鼠移植瘤放射敏感性的研究[J]. 中国癌症杂志 2016(07)
- [27].不同剂量顺铂对体外培养食管癌细胞敏感性研究[J]. 云南大学学报(自然科学版) 2013(S2)
- [28].吃咖喱有助杀死食管癌细胞[J]. 中华中医药学刊 2011(05)
- [29].沉默PGAM1基因对食管癌细胞生物学功能的影响[J]. 临床肿瘤学杂志 2018(09)
- [30].miR-148a对食管癌细胞迁移及侵袭的影响及潜在分子机制研究[J]. 中国现代医学杂志 2017(24)
标签：干扰论文; 细胞系论文; 小干扰论文; 人端粒酶逆转录酶论文; 端粒酶论文;