肺炎支原体感染的临床治疗分析及免疫学致病机制研究

论文摘要

目的肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）是人类支原体性肺炎的病原菌,近年来其感染表现为肺外并发症多样,难治性肺炎病例增多,其具体致病机制目前尚不明确。临床治疗MP感染的首选药物是大环内酯类抗生素,然而MP23SrRNA基因突变会导致大环内酯类抗生素耐药,国内外报道,MP耐药基因突变株不断增多,我国北京地区MP耐药基因检出率甚至高达90%。然而体外药物敏感性试验的结果不能代表药物体内真实的治疗效果,而且由于肺炎支原体分离培养困难,目前MP对大环内酯类药物的体外敏感性试验并不是临床常规检测项目。学者们建立了各种耐药基因突变检测方法,希望可以应用于临床肺炎支原体耐药性检测。本实验旨在通过分析大环内酯类抗生素对MP耐药基因突变株的临床治疗效果,评价进行MP耐药基因检测的临床意义,并通过MP感染的大鼠模型探讨MP致病的免疫学机制,以期为临床治疗肺炎支原体感染提供依据。方法1.MP感染的临床治疗分析。选取符合纳入条件的66例疑为支原体肺炎的住院患者,男33例,女33例,采集患者肺泡灌洗液、痰及咽拭子标本,PCR方法进行MP DNA检测及包含有突变位点的933bp片段扩增,扩增片段进行核酸序列测定。结合病历资料,选择病人发热天数、住院天数、使用激素及并发症出现情况做为分析指标,对耐药基因突变株与非突变株进行比较,分析大环内酯类抗生素对MP耐药基因突变株的临床治疗效果。2.MP免疫学致病机制研究。45只大鼠随机分为感染组25只,对照组20只,感染组在无菌操作台经鼻连续4天接种100μ1 （106CFU/ml）MP,对照组同样条件下经鼻连续4天接种100μ1MP液体培养基。接种完成后1、3、5、8、10天时,分批处死感染组和对照组大鼠,采集肺泡灌洗液和肺组织。采用荧光定量PCR方法测定大鼠肺泡灌洗液中MP DNA含量,ELISA方法检测肺泡灌洗液Th1/Th2类细胞因子,对大鼠肺组织标本进行HE染色后进行肺组织病理学评分。分析大鼠感染MP后肺泡灌洗液中Th1、Th2类细胞因子的动态变化,研究MP感染与机体免疫系统间的相互作用,了解其致病机制。结果1.66例病人中46例病人MPDNA阳性,20例为阴性,肺泡灌洗液、痰液、咽拭子MP分离率分别为69.7%、18.2%、6.1%,肺泡灌洗液分离率高于痰液和咽拭子（P<0.01）；46份MPDNA样品中有31份存在耐药基因突变,突变率为67.4%（31/46）,均为2063A→G突变,并未发现其它位点突变；耐药基因突变株（macrolide-resistant, MR）与非突变株（macrolide-susceptible, MS）病人的发热天数、住院天数、激素使用及并发症出现情况均无统计学差异（P值分别为0.459、0.632、0.793、0.575）。2.感染组大鼠造模后第三天炎症达到最重,肺组织病理评分为14.7（最高分为16分）,第五天炎症评分有所下降,病理评分为9.7分,对照组无明显病理改变,感染组荧光定量PCR在整个过程中均能检测到MP,且MPDNA含量相对稳定,天间相比并无统计学差异;大鼠Thl类细胞因子IFN-γ在感染MP后升高,第3天达到峰值,且IFN-γ的水平与肺组织病理学评分呈正相关（R=0.900,P<0.05）,而Th2细胞因子IL-4在感染后并无明显变化。结论本研究结果表明：MP大环内酯类耐药基因突变检出率为63.4%,均为2063A→G突变；MP耐药基因突变株与非突变株病人在发热天数、住院天数、激素使用情况及并发症情况上均无差别,大环内酯类抗生素对MP耐药基因突变株的治疗效果可能与其抑制细菌蛋白合成外的免疫调节活性有关,因此建议临床不必常规开展MP耐药基因检测；MP耐药不导致患者病程延长及并发症增多,因此推测本身携带耐药基因可能不是导致难治性MP肺炎的主要原因,具体机制还有待于进一步研究；MP感染大鼠后促进炎症的Thl类细胞因子升高,且其浓度与肺组织病理评分具有相关性,而起抗炎作用的Th2类细胞因子并无明显变化,大鼠Thl/Th2类细胞因子表达失衡,这初步揭示了MP致病的免疫学机制,也提示我们对于MP感染的治疗,可以从其致病的免疫学机制方面入手,采用一些免疫调节剂进行治疗。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、肺炎支原体感染的临床治疗分析
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 研究对象
• 1.1.2 试剂与仪器
• 1.1.2.1 材料与试剂
• 1.1.2.2 实验仪器与设备
• 1.1.3 方法
• 1.1.3.1 标本采集
• 1.1.3.2 标准菌株及临床标本中DNA的提取
• 1.1.3.3 PCR反应
• 1.1.3.4 PCR扩增产物凝胶电泳分析
• 1.1.3.5 PCR产物测序
• 1.1.3.6 治疗效果分析指标
• 1.1.4 统计学处理
• 1.2 结果
• 1.2.1 MP确证PCR结果
• 1.2.2 耐药基因检测结果
• 1.2.3 MR病人与MS病人治疗效果评价结果
• 1.3 讨论
• 二、肺炎支原体致病免疫机制研究
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 MP复苏培养及浓度测定
• 2.1.2.2 实验动物及接种
• 2.1.2.3 标本采集
• 2.1.2.4 肺组织病理学评分
• 2.1.2.5 肺泡灌洗液实时荧光定量PCR
• 2.1.2.6 肺泡灌洗液IL-4、IFN-γ测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 病理结果
• 2.2.2 TH1/TH2细胞因子结果
• 2.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述 肺炎支原体感染及耐药研究进展
• 综述参考文献
• 致谢