激活素A在糖尿病肾病小管间质纤维化中作用的实验研究

论文摘要

背景随着世界范围内糖尿病患者的迅速增加,糖尿病并发症对患者生存质量和死亡率的影响也越来越重要。糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一,也是导致终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）的主要原因。DN过去一直被认为是一种肾小球疾病,而新近的研究表明,小管损伤和进行性间质纤维化与DN的预后关系更为密切。为此,研究DN小管间质病变发生、发展的机制,对于寻找更加有效的治疗措施具有重要意义。DN小管间质病变的核心是细胞外基质（extracellular matrix,ECM）在损伤区的过量堆积。研究表明,由小管上皮细胞和间质成纤维细胞转分化而来的α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）阳性的肌成纤维母细胞是ECM的主要来源。多种细胞因子和生长因子参与了ECM的生成和降解,其中转化生长因子-β（transforming growth factor-beta,TGF-β）超家族成员发挥了重要作用。根据结构和和分子生物学差异,TGF-β超家族可以细分为三个主要家族:TGF-β、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）和激活素（activin,ACT）。研究表明,在实验性DN早期,TGF-β在小管上皮表达即明显上调,并可促进小管上皮细胞向肌成纤维母细胞转分化。体外培养的小管上皮细胞,高糖和糖基化终末期产物（advanced glycation end products,AGEs）均可通过TGF-β依赖的方式促进ECM成分的产生。BMP-7与TGF-β作用正好相反,内源性BMP-7可阻止小管上皮细胞ECM的产生。在实验性DN模型中,BMP-7及其受体表达均明显下调。ACT最早是在性腺发现的糖蛋白,因特异性促进垂体细胞合成及分泌卵泡刺激素（FSH）而得名。ACT是由两个β亚单位借二硫键构成的二聚体蛋白,按照β亚基构成的不同,ACT分为三种形式:ACTA（βAβA）、ACT B（βBβB）、ACTAB（βAβB）,目前研究最多的是ACTA。类似于TGF-β超家族其它成员,ACT A主要通过Smad信号途径介导其生物学效应。卵泡抑素（follistatin,Fs）是由性腺分泌的单链多肽,可抑制垂体FSH的分泌。FS与ACT有很强的亲和力,并阻断其生物学效应;二者共同构成一个维持组织器官正常生长和代谢的自动平衡系统。目前对于ACT A在肾小管间质病变中的作用机制研究甚少,ACT与DN小管间质纤维化之间的潜在联系尚待进一步研究。目的本研究通过体内链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病动物模型及体外高糖刺激的人近端肾小管上皮细胞株（HK-2）,探讨ACT A/Smad信号在糖尿病肾脏的表达及其与转分化标志物α-SMA和ECM成分纤维连接蛋白（FN）变化的关系。方法1.动物实验雄性Wistar大鼠,随机分成糖尿病组（DM）和对照组（NC）。DM组在禁食12小时后一次性腹腔注射STZ（60mg/kg）,NC组给予相同剂量的溶媒。给药72h后尾静脉采血测随机血糖（BG）＞16.7mmol/L为糖尿病大鼠。所有大鼠标准饲料饲养,自由饮水。各组分别于造模后4、8、12、16周处死大鼠6只。处死前1天,大鼠称重后单只置于代谢笼中,准确收集24h尿液。腹主动脉取血后分离左肾,部分肾组织固定于10%多聚甲醛供病理及免疫组化检查,另一部分置液氮待做PCR检测。肾脏肥大指数用左肾重/体重（KW/BW）表示;放免法测定尿白蛋白排泄率（AER）;BG、血肌酐（Scr）及尿肌酐（Ucr）用HITACHI-7150自动生化分析仪检测,肌酐清除率（Ccr）按公式:Ucr×每分钟尿量（ml）/Scr计算,并以体重校正。光镜观察肾组织形态学变化;免疫组化检测肾组织中ACTβA、FS、P-Smad2/3、α-SMA和FN蛋白表达;real time-PCR检测肾组织中ACTβA、FS、α-SMA和FNmRNA的表达。2.细胞培养HK-2细胞生长于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基,置37℃含5%CO2的培养箱中孵育。待细胞生长至亚融合状态时,更换为无血清DMEM培养基使细胞生长同步化24h,然后将细胞分为以下5组:正常对照组（NG,5.5mmol/L葡萄糖）、甘露醇对照组（MG,5.5mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇）、高糖组（HG,25mmol/L葡萄糖）、HG+FS100组（25mmol/L葡萄糖+100ng/mlFS）、HG+FS500组（25mmol/L葡萄糖+500ng/mlFS）。12、24、48h后收集各组细胞及细胞上清液。Western blot检测各组细胞ACTβA和P-Smad2/3的表达;ELISA检测各组细胞上清液TGF-β、α-SMA和FN的含量。结果1.动物实验1.1一般生化指标的变化在各时间点,DM组大鼠血糖明显高于NC组。DM组大鼠KW/BW、AER及Ccr从第8周开始升高,并呈逐渐增高趋势,与NC组相比差异有统计学意义（P＜0.01）;DM组内16周末与8周末比较有统计学差别（P＜0.01）。1.2肾小管间质组织病理改变PAS染色结果显示,各时间点NC组肾小管结构正常,没有间质水肿和纤维化。DM组大鼠自实验第8周起可见部分肾小管上皮细胞空泡变性,肾小管肥大、扩张和萎缩,肾间质可见纤维化,随时间延长病变逐渐加重,肾小管间质损伤指数逐渐增加。1.3免疫组化检测肾小管间质ACTβA、FS、P-Smad2/3、α-SMA和FN的表达免疫组化结果显示,NC组大鼠在肾小球、肾小管及间质均未检测到ACTβA的表达;DM组大鼠肾小管上皮细胞ACTβA阳性表达自第4周起逐渐增加,并于12周时达峰值。与之相反,FS在NC组大鼠肾小管上皮细胞大量表达,在DM组其表达从第4周开始逐渐下降。P-Smad2/3和FN在NC组肾小管和间质有轻度表达,而在DM组大鼠从第8周起表达量逐渐增加,并一直持续到第16周。α-SMA在NC组仅表达于脉管系统,DM组除血管壁外,从第8周开始,肾小管和肾间质表达亦明显增加。1.4肾组织ACTβA、FS、α-SMA和FNmRNA的表达ACTβA mRNA在NC组只有极微量表达,而DM组大鼠肾组织ACTβAmRNA从第4周起即开始增加（NC组的3.3倍）,于12周时达峰值（NC组的7.7倍）,16周时表达量略有下降,但仍明显高于NC组（P＜0.01）;与之相反,FS在NC组大量表达,而DM组表达逐渐减少,实验第4周和12周时与NC组相比分别下降了32.5%和52.9%。与NC组相比,4周时DM组肾组织α-SMA和FN mRNA表达无明显改变,但从第8周起逐渐增加,并于第16周时达峰值。2.细胞培养2.1 ACTβA和P-Smad2/3在HK-2细胞的表达及FS的干预作用Western blot检测结果显示,ACTβA在NG组细胞有微量表达,而HG组ACTβA表达显著增加,呈时间依赖性。与HG组相比,FS干预组ACTβA表达显著减少,呈剂量依赖性;高糖培养48h后,HG+FS500组ACTβA表达与NG组相比无统计学差异（P＞0.05）。与NG组相比,P-Smad2/3在HG组培养24h后表达明显增加;FS可抑制P-Smad2/3的高表达,高糖培养48h后,HG+FS100组和HG+FS500组与HG组相比,P-Smad2/3表达分别下降了26%和41%。MG组细胞中ACTβA和P-Smad2/3表达与NG组相比无统计学差异（P＞0.05）。2.2 TGF-β、α-SMA和FN在HK-2细胞上清的表达及FS的干预作用ELISA检测结果显示,与NG组相比,HG组培养12h后TGF-β表达即显著增加,呈时间依赖性,FS干预对高糖诱导的TGF-β高表达没有影响。与NG组相比,HG组培养24h后α-SMA和FN表达显著增高（P＜0.01）,FS对此有明显抑制作用,呈剂量依赖性（P＜0.01）。MG组TGF-β、α-SMA和FN的表达与NG组相比无统计学差异（P＞0.05）。结论1.糖尿病大鼠肾小管间质存在ACT A/Smad信号蛋白的上调,同时转分化标志物α-SMA和ECM成分FN的合成增加。2.高糖能刺激HK-2细胞ACT A/Smad信号蛋白活化,并促进肾小管上皮细胞转分化标志物α-SMA和ECM成分FN的合成。3.FS可通过阻断高糖诱导的ACT A表达,从而阻抑高糖诱导的Smad信号活化,减轻肾小管上皮细胞转分化和FN的合成。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 引言
• 第一部分 激活素A在糖尿病大鼠肾小管间质的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图与附表
• 第二部分 激活素A在高糖诱导的HK-2细胞的表达及卵泡抑素的干预作用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 全文总结
• 参考文献
• 综述1
• 综述2
• 在读期间发表文章及奖励
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 发表文章1
• 发表文章2