论文摘要
新型环境持久性有机污染物全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS），性质稳定蓄积性强，由PFOS污染带来的健康危害已越来越引起人们关注。PFOS不但可诱导肝脏、神经、免疫及内分泌系统的损害，而且对动物的生殖发育也有影响。近年来在PFOS生殖毒性研究中，主要关注了PFOS对雄性的内分泌干扰作用，以及经此途径诱导雄性生殖损伤相关分子机制。然而，对于PFOS是否能够通过血—睾屏障进入睾丸及是否能够发挥直接破坏作用尚未见报道。血—睾屏障是广泛存在于哺乳动物睾丸中的一种特殊的“血—组织”屏障结构，对维持正常的精子发生具有重要意义。近年来，血—睾屏障在外源性化学物诱导的雄性生殖损害过程中的作用越来越引起关注。PFOS若存在睾丸的直接损伤，需通过血—睾屏障进入睾丸实质，阐明PFOS影响血—睾屏障及其分子机制有助于全面认识PFOS诱导的雄性生殖损伤过程。本研究紧紧围绕上述问题，建立整体及体外PFOS染毒模型，评估血—睾屏障结构和功能的变化，分析血—睾屏障相关连接蛋白表达及定位改变，寻找睾丸内PFOS毒作用关键的靶细胞和靶分子，明确关键信号通路在PFOS调控血—睾屏障中的作用，从而深入探讨PFOS对血—睾屏障结构和功能影响的分子机制。为化学物的生殖毒理学研究提供提供有益的补充和技术支撑，也为环境持久性有机污染物的生殖风险评估、危害控制及预防提供重要参考。第一部分：PFOS致雄性小鼠生殖毒效应的研究目的：建立PFOS雄性生殖损伤模型，明确PFOS对睾丸的直接损伤作用，寻找关键的靶细胞。方法：一定剂量的PFOS给予ICR小鼠经口灌胃染毒，通过体重及脏器系数观察一般毒性；运用放免法检测血清生殖相关激素观察PFOS内分泌干扰效应；运用光镜及电镜在形态上观察睾丸生精上皮的破坏，寻找关键的靶细胞。采用计算机辅助精子分析系统（Computer-assisted sperm analysis，CASA）观察精子相关参数，确认PFOS对精子发生的影响。结果：1.一般毒性：在050mg/kg/d剂量下，PFOS未对动物生长发育产生显著影响，睾丸和附睾的脏器系数也未出现显著改变。2.血清生殖激素：与对照组相比，PFOS可显著诱导动物血清睾酮（Testosterone，T）水平降低，而其它如雌激素（Estradiol，E2）、促卵泡生成素（Follicle-stimulating hormone，FSH）、促黄体生成素（Luteinizinghormone，LH）变化则不显著。3.睾丸形态学：光镜下，PFOS可显著诱导睾丸支持细胞空泡化，在高剂量组生精小管腔可见自生精上皮剥脱的未成熟生精细胞。电镜下，与对照组相比，2.5、25和50mg/kg/d剂量组睾丸出现显著的支持细胞空泡化改变，细胞内出现较多脂滴。4.精子参数：PFOS可显著降低动物精子计数，并呈剂量依赖关系，尤其在2.5、25和50mg/kg/d剂量组（0.25和2.5mg/kg/d剂量组，p<0.05；25和50mg/kg/d剂量组，p<0.01）。50mg/kg/d剂量的PFOS可显著降低精子活动率（p<0.05），25和50mg/kg/d剂量的PFOS可显著降低快速细胞百分率（25mg/kg/d剂量组，p<0.05；50mg/kg/d剂量组，p<0.01）。第二部分：PFOS对小鼠血—睾屏障结构及功能的影响目的：探讨PFOS对血—睾屏障结构和功能的影响，在整体水平分析相关的分子机制。方法：利用已建立的PFOS染毒小鼠模型，采用电镜观察PFOS对血—睾屏障结构的破坏；利用生物素示踪剂观察PFOS对血—睾屏障功能的影响；运用UPLC/MS/MS检测血清及睾丸中的PFOS暴露，分析PFOS通过血—睾屏障的能力；采用免疫印迹和免疫组化检测睾丸组织血—睾屏障相关连接蛋白的表达和定位，探讨关键的靶分子和相关分子机制。结果：1.血—睾屏障超微结构：与对照组相比，2.5到50mg/kg/d剂量组血—睾屏障超微结构出现明显的肌动蛋白束缺失，紧密连接解体和囊泡。2.血—睾屏障功能：与对照组相比，2.5到50mg/kg/d剂量组的睾丸组织可见生物素示踪剂跨过血—睾屏障进入生精小管的顶端室。3. PFOS通过血—睾屏障的能力：与对照组相比，在各PFOS处理组的血清和睾丸样品中均可检测出PFOS。血清PFOS水平与睾丸PFOS含量呈正相关（相关系数=0.9676，Pearson，p<0.0001）4.血—睾屏障连接相关蛋白的表达和定位：PFOS可下调睾丸紧密连接相关蛋白（Tight junction，TJ）：ZO-1（2.5，25和50mg/kg/d剂量组，p<0.01）、 Claudin-11和Occludin （2.5mg/kg/d剂量组， p<0.05；25和50mg/kg/d剂量组，p<0.01）的表达。同样缝隙连接相关蛋白（Gap junction，GJ）：Connexin-43（25和50mg/kg/d剂量组，p<0.05）和p-Connexin-43（2.5，25和50mg/kg/d剂量组，p<0.05）表达也下调，并呈剂量依赖关系。此外，2.5到50mg/kg/d剂量的PFOS还可显著降低ZO-1、Claudin-11、Occludin和Connexin-43血—睾屏障处的定位。5.丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的激活：磷酸化的Erk和p-38表达显著增加（p-Erk，25和50mg/kg/d剂量组，p<0.01；p-p38，2.5mg/kg/d剂量组，p<0.05，25和50mg/kg/d剂量组，p<0.01）。第三部分：PFOS靶向Sertoli细胞影响血—睾屏障功能的机制研究目的：探讨支持细胞在PFOS诱导的血—睾屏障破坏过程中的作用，分析血—睾屏障连接相关蛋白表达和定位改变与MAPK信号通路激活的关系。方法：采用细胞毒性实验筛选对PFOS敏感细胞株，验证整体水平的结果；运用RT-PCR的方法鉴定支持细胞株上PFOS相关转运体的表达，验证PFOS靶向支持细胞作用可能的途径。采用免疫印迹和免疫荧光分析血—睾屏障相关连接蛋白的表达和定位，验证整体水平的结果，并探讨相关的分子机制。运用MAPK信号通路特异性抑制剂联合PFOS共同处理支持细胞，采用免疫印迹法及免疫荧光分析关键连接蛋白表达的变化，确认MAPK信号通路与支持细胞上血—睾屏障连接相关蛋白表达和定位改变的关系。采用原代支持细胞对部分重要结果进行验证。结果：1.细胞毒性实验结果：相对其它睾丸细胞株，支持细胞株（TM4）对PFOS毒作用相对敏感。2. PFOS相关转运体的鉴定：支持细胞株上表达有OAT1、OATP1和OATP3。3.支持细胞血—睾屏障相关连接蛋白的表达及定位：PFOS可显著诱导连接蛋白Claudin-11、ZO-1、Occludin、Connexin-43和p-Connexin-43表达下调（p<0.05或p<0.01）。Claudin-11和Connexin-43的细胞定位：随着剂量增加，细胞浆Claudin-11表达显著下降，尤其在高剂量组（100和150μM）。Connexin-43主要表达在细胞膜上，随着PFOS剂量增加，表达也呈下降趋势。4. MAPK特异性抑制剂与PFOS联合处理后血—睾屏障相关蛋白的表达和定位：JNK和Erk MAPK信号通路特异性抑制剂不能逆转PFOS诱导的连接蛋白下调。与之相反，p-38MAPK信号通路特异性抑制剂可显著抑制PFOS诱导的连接蛋白表达下调及细胞膜定位减少。5.原代支持细胞验证：PFOS可诱导原代支持细胞屏障功能下降及TJ蛋白（ZO-1、Claudin-11和Occludin）和GJ蛋白（Connexin-43和p-Connexin-43）表达的下调（20和30μM，p<0.05或p<0.01）；p-38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580可显著抑制PFOS诱导原代支持细胞屏障功能的下降及连接蛋白表达的下调。结论1. PFOS可诱导雄性ICR小鼠生殖损伤，支持细胞很可能是PFOS的重要作用靶点。2. PFOS可破坏血—睾屏障结构和功能，使得PFOS能进入生精上皮，从而发挥直接的生殖毒作用。血—睾屏障连接相关蛋白ZO-1、Claudin-11、Occludin、Connexin-43和p-Connexin-43很可能是PFOS毒作用的靶分子，与PFOS诱导的血—睾屏障结构和功能破坏有关。3. PFOS可能通过靶向支持细胞，激活p38MAPK信号通路，下调血—睾屏障连接相关蛋白的表达及细胞定位，从而诱导血—睾屏障结构和功能的破坏。该机制在PFOS诱导的雄性生殖损伤中可能起关键作用。