论文题目: 基于菌种层面的纯生啤酒泡沫稳定性的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 食品科学
作者: 王肇悦
导师: 何国庆
关键词: 啤酒酵母,纯生啤酒,酵母蛋白酶,脂肪转运蛋白,泡沫稳定性,基因敲除
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 酵母蛋白酶A是啤酒酵母中的一种蛋白水解酶,啤酒中残留的酵母蛋白酶A对啤酒泡沫有负面作用。该水解酶底物特异性较小,因此对蛋白质、生色肽及荧光肽均可水解。其中以蛋白质为底物时的酶活性测定方法方便快捷,但是当酵母蛋白酶A酶活性较低时,产物采用紫外吸收法以及Lowry法的检测灵敏度都比较低。为了能快速简便地测定酵母蛋白酶A活性,本文仍选用较传统的酪蛋白及血红蛋白为底物,但对产物检测方法做了改进,使用改进的Bradford法的检测结果表明,该方法检测灵敏度大大提高。采用本文酵母蛋白酶A测定方法时,要首先通过盐析获得酵母中或纯生啤酒中蛋白酶A,通过不同饱和度条件下得到的啤酒酵母及纯生啤酒中酵母蛋白酶A的酶活力比较发现,从酵母中提取蛋白酶A时宜采用70-80%盐析饱和度。提取纯生啤酒中蛋白酶A宜采用50%盐析饱和度。 一些学者电泳分析的啤酒蛋白通常为层析纯化后的样品,本文通过对比在不同盐浓度、不同凝胶浓度以及不同染色条件下的啤酒样品的电泳图谱,首先确定了不经过任何处理、可以直接使用的啤酒样品的最佳电泳条件及染色方法,然后通过此方法对啤酒及其泡沫中的几种主要蛋白成分进行了鉴定,电泳结果表明,啤酒原液与啤酒泡沫中蛋白组成相似,其主要蛋白均为分子量分别为40 KDa和10 KDa的蛋白质Z和脂肪转运蛋白(LTP1)。通过啤酒蛋白与酵母蛋白酶A反应液的电泳分析,初步确定酵母蛋白酶A对啤酒泡沫中脂肪转运蛋白有水解作用。 通过测定纯生啤酒存放过程中酵母蛋白酶A活性交化、泡持性衰减以及蛋白含量的变化,进一步说明了酵母蛋白酶A以及蛋白种类与含量对纯生啤酒泡沫稳定性的影响及其相互关系。对不同存放时期纯生啤酒样品进行电泳鉴定的结果显示,脂肪转运蛋白含量逐渐减少,存放三月后,该蛋白完全消失,这_结果表明脂肪转运蛋白是啤酒泡沫稳定性的主要蛋白,该蛋白的降解可能是酵母蛋白酶A作用的结果。 本文作者首次从鲜啤酒中提取酵母蛋白酶A,并通过凝胶层析(Sephadex G-100)和离子交换层析(DEAE Sephadex A50)将该酶进行了纯化。酵母蛋白酶A经凝胶层析纯化后,酶比活力提高为原来的5.3倍,得率为7%;离子交换凝胶进一步纯化后,酶比活力提高到原来的10.1倍,得率为1%。两种方法纯化后的蛋白酶A经电泳鉴定,
论文目录:
目录
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1．前言
2．影响纯生啤酒泡沫稳定性的因素
2．1 啤酒泡沫特性
2．2 泡沫化学组成
2．3 影响熟啤酒泡沫的主要因素及影响机理
2．3．1 影响熟啤酒泡沫的主要因素
2．3．2 蛋白质Z及LTP1对啤酒泡沫的影响机理
2．4 影响纯生啤酒泡沫的主要因素——酵母蛋白酶A
2．4．1 前蛋白酶A原、蛋白酶A原及蛋白酶A的分子生物学特征
2．4．2 酵母蛋白酶A的结构与功能
2．4．3 酵母蛋白酶A的动力学特征
2．4．4 啤酒酿造过程中影响蛋白酶A活性的因素
3．纯生啤酒泡沫稳定性的改善策略
3．1 原料选择与工艺控制
3．2 用抑制剂对啤酒进行后修饰
3．3 培育富含泡沫阳性蛋白大麦品种
3．4 培育酵母蛋白酶A缺陷型菌株
4．基因敲除法构建酵母蛋白酶A缺陷型菌株
4．1 反向遗传学概述
4．2 基因敲除的遗传学基础
4．3 基因敲除技术的发展及基本步骤
4．4 基因敲除技术的应用
4．5 前景与展望
5．研究现状
6．本论文研究思路
参考文献
第二章 酵母蛋白酶A测定方法的改进及其在纯生啤酒中的应用
1．前言
2．材料与方法
2．1 材料及主要试剂
2．2 仪器
2．3 实验方法
2．3．1 酵母蛋白酶A粗提液制备
2．3．2 底物制备方法
2．3．3 酵母蛋白酶A酶活性测定方法
3．结果与分析
3．1 血红蛋白为底物时酵母蛋白酶A活性的测定
3．1．1 血红蛋白为底物时酶浓度对蛋白酶A活性的影响及不同检测方法比较
3．1．2 血红蛋白为底物时底物浓度对蛋白酶A活性的影响及不同检测方法比较
3．2 酪蛋白为底物时酵母蛋白酶A活性的测定
3．2．1 酪蛋白为底物时酶浓度对蛋白酶A活性的影响及不同检测方法比较
3．2．2 酪蛋白为底物时底物浓度对蛋白酶A活性的影响及不同检测方法比较
3．3 不同饱和度硫酸铵盐析后酵母提取液中酵母蛋白酶A活性的比较
3．4 纯生啤酒在不同饱和度条件下盐析后酵母蛋白酶A活性的比较
4．讨论与结论
参考文献
第三章 啤酒泡沫蛋白的电泳分离及其与酵母蛋白酶A的关系
1．前言
2．材料与方法
2．1 材料及主要试剂
2．2 仪器
2．3 实验方法
2．3．1 啤酒泡沫的提取
2．3．2 啤酒蛋白的电泳分离
2．3．3 凝胶染色
2．3．4 蛋白含量的测定
2．3．5 凝胶图象分析
2．3．6 酵母蛋白酶A粗提液的制备方法
2．3．7 酵母蛋白酶A粗提液对啤酒蛋白的水解作用
3．结果与分析
3．1 电泳染色方法比较以及电泳条件的确定
3．1．1 不同染色方法的对比
3．1．2 电泳条件的确立
3．2 啤酒泡沫蛋白与酵母蛋白酶A关系
4．讨论与小结
参考文献
第四章 纯生啤酒存放过程中泡沫稳定性与蛋白组成以及蛋白酶A的变化
1．前言
2．材料与方法
2．1 材料及主要试剂
2．2 主要仪器
2．3 实验方法
2．3．1 纯生啤酒中酵母蛋白酶A粗提液制备及酶活性测定
2．3．2 纯生啤酒存放过程中泡持时间测定
2．3．3 纯生啤酒存放过程中蛋白含量的测定
2．3．4 不同存放时间纯生啤酒泡沫蛋白的电泳分离
3．结果与分析
3．1 纯生啤酒存放过程中酵母蛋白酶A的变化及影响因素
3．2 纯生啤酒存放过程中泡持性与泡沫变化及影响因素
3．3 纯生啤酒存放过程中蛋白含量的变化及影响因素
3．4 纯生啤酒存放过程中蛋白组成的变化
4．讨论与小结
参考文献
第五章 酵母蛋白酶A的分离纯化及其对啤酒泡沫蛋白的特异性
1．前言
2．材料与方法
2．1 材料及主要试剂
2．2 仪器
2．3 实验方法
2．3．1 蛋白酶A粗提液制备
2．3．2 蛋白含量的测定
2．3．3 酶活性测定方法
2．3．4 凝胶层析纯化酵母蛋白酶A
2．3．5 离子交换层析纯化酵母蛋白酶A
2．3．6 纯化酵母蛋白酶A的电泳鉴定
2．3．7 纯化酵母蛋白酶A对啤酒蛋白的水解
3．结果与分析
3．1 蛋白酶A的分离纯化
3．2 纯化后蛋白酶A的电泳鉴定
3．3 蛋白酶A对啤酒蛋白的水解及鉴定
4．讨论与结论
参考文献
第六章 基因敲除法构建酵母蛋白酶A缺陷型菌株
1．前言
2．材料与方法
2．1 材料及主要试剂
2．1．1 酵母菌株及质粒
2．1．2 引物
2．1．3 培养基
2．1．4 工具酶和试剂
2．2 仪器
2．3 实验方法
2．3．1 转化DNA的合成
2．3．2 琼脂糖凝胶电泳
2．3．3 酵母感受态细胞的制备、转化及筛选
2．3．4 基因组DNA提取及转化菌鉴定
3．结果与讨论
3．1 转化DNA的PCR合成及电泳鉴定
3．2 转化菌筛选
3．3 转化菌PCR鉴定
4．结论
参考文献
第七章 蛋白酶A缺陷型酵母菌株及对照菌的性能比较
1．前言
2．材料与方法
2．1 材料及主要试剂
2．1．1 酵母菌株
2．1．2 培养基
2．1．3 工具酶和主要试剂
2．2 仪器
2．3 实验方法
2．3．1 转化菌及对照菌继代培养
2．3．2 转化菌PCR鉴定
2．3．3 蛋白酶A提取及活性测定
2．3．4 酵母菌蛋白的PAGE鉴定
2．3．5 转化菌遗传霉素抗性稳定性鉴定
2．3．6 生长性能试验
2．3．7 发酵力试验
2．3．8 酵母凝聚性试验
2．3．9 热死灭温度试验
3．结果与讨论
3．1 转化菌蛋白酶A缺失的遗传稳定性
3．1．1 转化菌PCR鉴定
3．1．2 蛋白酶A活性
3．1．3 酵母菌蛋白的PAGE鉴定
3．2 转化菌遗传霉素抗性稳定性
3．3 生长性能
3．4 发酵度与发酵速率
3．5 酵母凝絮性
3．6 热死灭温度
4．结论
参考文献
第八章 酵母蛋白酶A缺陷型酵母菌株啤酒酿造
1．前言
2．材料与方法
2．1 酵母菌株及原料
2．2 主要仪器
2．3 实验方法
2．3．1 扩培麦汁培养基的制备
2．3．2 啤酒酿造试验方法
2．3．3 理化指标及性能分析
2．3．4 酵母及啤酒中蛋白酶A提取及活性测定
2．3．5 酵母菌蛋白的SDS-PAGE鉴定
3．结果与讨论
3．1 各种理化指标测定结果
3．2 酵母菌性能测试
3．3 蛋白酶A活性测定
3．4 酵母菌蛋白的SDS-PAGE鉴定
4．小结
参考文献
第九章 主要结论
致谢
个人简介及攻读博士学位期间撰写的论文
发布时间: 2005-07-15
参考文献
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