论文摘要
肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生发展的重要机制。近年来的研究表明一群重要的T细胞亚群-CD4+CD25+调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）可能在肿瘤免疫逃逸中起了关键作用。CD4+CD25+调节性T细胞是Sakaguchi等首先报道的一群具有免疫调节功能的T细胞亚群,其主要通过细胞与细胞接触的方式发挥作用,能显著抑制多种免疫细胞的功能。现有的研究显示CD4+CD25+调节性T细胞在肿瘤免疫、感染免疫、自身免疫以及移植免疫中均扮演了重要角色。近年来的研究显示,Treg是一群异质性T细胞群体,Treg的不同亚群在机体免疫反应中的作用不同,这显示了机体免疫调节的复杂性。如已有研究报道在正常个体中存在Treg的记忆亚群-CD4+CD25+CCR6+调节性T细胞,其具有记忆效应表型,并在EAE发生过程中发挥了重要作用。而对Treg不同亚群功能的深入研究不但对于免疫反应调节机制的探讨和阐明,而且对于免疫反应的有效干预均具有重要作用。对于长期的肿瘤发生发展而言,越来越多的研究表明记忆性T细胞在肿瘤的免疫逃逸中发挥了重要作用,并且研究者们已发现在肿瘤患者的引流淋巴结中和肿瘤局部存在的Treg高表达记忆标志CD45RO。据此,我们推测肿瘤局部是否也存在CD4+CD25+调节性T细胞的记忆亚群,如果存在,其功能如何?本研究中,我们通过对小鼠肿瘤实验动物模型和临床乳腺癌肿瘤患者中Treg记忆亚群(CD4+CD25brihtCCR6+调节性T细胞)的检测为基础,探讨了其在肿瘤免疫逃逸中的作用及可能的机制,以期为研究调节性T细胞在肿瘤局部免疫反应中的作用和为肿瘤免疫治疗提供新的靶点。一、肿瘤动物模型和临床肿瘤标本中CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞的检测1.CD4+CD25brightCCR6+T细胞在肿瘤动物模型中的的分布我们根据文献报道,先建立了BALB/c小鼠的4T1荷瘤模型,然后用FACS检测了CD4+CD25bright调节性T细胞在荷瘤小鼠和正常小鼠中CCR6的表达情况并观察了CD4+CD25brightCCR6+T细胞在荷瘤宿主中的分布情况。结果发现,与正常对照组一样,CD4+CD25brightCCR6+T细胞在外周免疫器官和淋巴组织均存在分布,不同的是CD4+CD25brightCCR6+T细胞在肿瘤浸润淋巴细胞中的比例明显高于引流淋巴结和其他淋巴组织,具有明显的富集现象。CD4+CD25brightCCR6+T细胞在肿瘤局部的富集现象在4T1同系细胞株Renca荷瘤模型与不同遗传背景细胞株3LL荷瘤模型中也得到了证实。2.CD4+CD25brightCCR6+T细胞体外功能的检测我们进一步用FACS分选出CD4+CD25brightCCR6+T细胞和CD4+CD25brightCCR6-T细胞,在体外观测它们对CD4+CD25-T细胞增殖的影响。结果发现CD4+CD25bright调节性T细胞的CCR6+和CCR6-两个亚群均可以在体外抑制CD4+CD25-T细胞的增殖,表现了抑制功能。以往研究表明CD4+CD25+调节性T细胞主要通过细胞与细胞接触的方式抑制效应T细胞的功能。因此我们用Trans-well模型在体外进一步观察了CD4+CD25brightCCR6+T细胞的体外抑制作用方式。结果显示,CD4+CD25brightCCR6+T细胞在体外也主要是通过细胞接触的方式发挥免疫抑制作用。另外,记忆性T细胞具有比na（?）veT细胞更低的刺激阈,其对CD28分子传递的第二信号的依赖明显低于naiveT细胞,具有回忆反应。因此我们接着观察了CD4+CD25brightCCR6+T细胞对TCR第一信号刺激的反应性。结果发现在只有TCR第一信号刺激而无CD28第二信号刺激的条件下CD4+CD25brightCCR6+T细胞的增殖和细胞因子IL-10的分泌水平均明显高于CD4+CD25brightCCR6-T细胞,具有明显的回忆反应。这些结果表明CCR6+Treg具有调节记忆样功能。3.CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞在乳腺癌病例中的检测为了进一步确定CD4+CD25brightCCR6+T细胞在肿瘤局部的富集现象,我们还检测了乳腺癌临床患者中CD4+CD25brightCCR6+T细胞在肿瘤浸润淋巴细胞和外周血中的变化。结果发现在22例临床乳腺癌患者病例中同样存在CCR6+Treg,能有效抑制CD4+效应T细胞的增殖,并且在TILs中也存在明显的富集。二、CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞在肿瘤免疫逃逸中的作用1.CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞对肿瘤特异性CD8+T细胞功能的抑制作用为了观察CCR6+Treg在肿瘤免疫中的作用,我们将4T1荷瘤模型中的CCR6+Treg和CCR6-Treg用FACS分选出来,同时分选4T1特异性CD8+T细胞（通过灭活4T1免疫BALB/c小鼠获得）,然后共转输4T1荷瘤的BALB/c背景的裸鼠,观察CCR6+Treg和CCR6-Treg体内对CD8+CTL功能的作用。结果显示虽然CCR6-Treg共转输可以有效抑制CD8+T细胞的抗肿瘤作用,但CCR6+Treg共转输组的肿瘤生长明显快于单独4T1特异性CD8+T细胞转输组和CCR6-Treg共转输组,生存时间显著缩短,并且肺转移指数也明显增加。为了观察CD8+T细胞功能的变化,我们用CFSE标记4T1特异性CD8+T细胞,重复上述实验,结果显示CCR6-Treg在体内可以有效抑制CD8+T细胞的增殖,但CCR6+Treg对CD8+T细胞的体内增殖的抑制作用更显著。另外我们还检测了CD8+T细胞细胞因子IFN-γ,的分泌,结果也显示CCR6+Treg可以更有效的抑制CD8+T细胞IFN-γ的分泌2.CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞在肿瘤局部的富集肿瘤免疫中调节性T细胞在肿瘤免疫局部发挥免疫抑制效应,而调节性T细胞的数量是其功能发挥的重要因素。因此我们推测CCR6+Treg和CCR6-Treg在体内功能的差异,是否与其在肿瘤局部和或引流淋巴结中的数量有关。因此我们用免疫荧光法检测了4T1荷瘤裸鼠转输模型中肿瘤局部Treg的数量。结果发现,在CCR6+Treg转输组肿瘤局部有更多的CCR6+Treg富集,而CCR6-Treg转输组则较少。为了进一步确定该结果,我们又检测了转输组肿瘤引流淋巴结中Treg的比例,结果发现,在引流淋巴结中,CCR6+Treg转输组的Treg比例也是高于CCR6-Treg转输组的。这些结果表明,CCR6+Treg在体内抑制功能的发挥可能与其数量有关。三、CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞在肿瘤免疫逃逸中的可能作用机制1.CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞在肿瘤免疫中的增殖与na（?）ve的T细胞相比,记忆性T细胞具有更好的增殖能力,因此我们推测CCR6+Treg在肿瘤局部中的数量增加是否与其增殖能力有关。首先,我们用Brdu掺入法检测了荷瘤小鼠中CCR6+Treg和CCR6-Treg的增殖情况。结果发现,在荷瘤状态下,CCR6+Treg具有明显的增殖,但CCR6-Treg的增殖并不显著。为了进一步确定在荷瘤宿主中CCR6+Yreg的体内增殖能力,我们将CFSE标记的CCR6+Treg和CCR6-Treg转输到4T1荷瘤的裸鼠体内,观察其增殖情况。结果也发现CCR6+Treg的增殖能力明显强于CCR6-Treg。这些结果提示我们CCR6+Treg在荷瘤状态下具有良好的增殖能力。2.CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞在肿瘤免疫中的增殖对于其抑制功能的作用为了确定CCR6+Treg体内增殖与其体内数量和抑制功能的关系,我们用长春花碱预处理4T1荷瘤小鼠,然后分选CCR6+Treg,再将其与4T1特异的CD8+T细胞共转输4T1荷瘤的裸鼠,结果发现CCR6+Treg对CD8+T细胞抗肿瘤效应的抑制作用明显减弱,并且在引流淋巴结中,CCR6+Treg的比例也显著降低。另外,BrdU掺入法检测也发现在vinblastine预处理CCR6+Treg共转输组中,CD8+T细胞的增殖得到明显改善,并且荷瘤小鼠生存时间得到了明显延长,而vinblastine对CCR6-Treg体内抑制作用的影响并不显著。同时检测的结果证实vinblastine预处理的CCR6+Treg其体内增殖明显减弱。这一结果提示我们CCR6+Treg的增殖对于其体内数量的维持和功能的发挥具有重要作用。3.DCs诱导CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞的增殖现有的文献报道DCs能以TGF-β依赖的方式刺激Treg的体内增殖。因此为了探讨CCR6+Treg体内增殖的机制,我们先检测了DCs在肿瘤局部的比例变化,结果发现DCs在肿瘤局部的比例也是增加的,并且表现为未成熟状态。进一步的体外实验表明DCs可以推动CCR6+Treg的增殖,而巨噬细胞和B细胞的刺激作用并不显著,并且抗TGF-β的阻断抗体和MHC-Ⅱ类分子抗体可以有效抑制DCs对CCR6+Treg体外增殖的作用。另外,我们还检测了DCs扩增的CCR6+Treg的CCR6和Foxp3的表达,结果发现DCs扩增后的CCR6+Yreg维持CCR6和Foxp3的表达。为了进一步确定DCs对CCR6+Treg增殖的作用,我们还检测了DCs扩增后CCR6+Treg的抑制功能,结果发现DCs扩增的CCR6+Treg能维持其抑制功能。最后,我们用CFSE标记CCR6+Treg,进一步在体内观察了DCs对CCR6+Treg的增殖刺激作用。这些结果表明DCs在CCR6+Treg体内增殖中发挥了重要作用。综上所述,在本研究中我们发现在肿瘤免疫中存在CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞亚群,其具有记忆样功能,并且在肿瘤局部有明显的富集;CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞以抗原非特异性的方式在体内抑制CD8+T细胞的功能;更重要的是这种抑制功能是与其增殖能力密切相关的;肿瘤免疫中未成熟DCs在CD4+CD25brightCCR6+调节性T细胞的体内增殖中发挥重要作用。本研究为肿瘤免疫逃逸机制的探讨和肿瘤免疫治疗策略的改进提供了实验基础,并为肿瘤治疗靶点的选择提供了新的思路。