论文摘要
背景和目的：研究表明,多种因素,包括压力负荷、缺血,缺血再灌注损伤、饥饿、蛋白质聚集等因素均能激活自噬,自噬是体内广泛存在的高度保守过程,对受损的蛋白及器官进行降解的过程。我们实验室之前研究发现高度表达Hsp27（heat shock protein 27）诱导还原应激及蛋白质聚集,致心肌病。自噬对细胞起保护或损伤性作用,目前尚不清楚。本研究旨在探讨自噬在心肌特异性高表达Hsp27致心肌病中的作用及机制初探。方法：1.实验动物来源：过表达人类Hsp27B基因的转基因鼠（Hsp27B transgenic mice,Hsp27 Tg）由本课题组、南京大学模式动物研究所共同构建,饲养于南京大学模式动物研究所的SPF级动物房中。2.心脏质量检测：称量并计算心脏重/体重比（Heat Weight/Body Weight, HW/BW）和心脏重/胫骨长比（heat weight/tibialength,HW/TL）,组织切片比较二尖瓣平面心脏大小。3.心功能及心脏结构检测：1)超声心动图检测左室射血分数（ejection fraction,EF%）及左室缩短率（fractional shortening,FS%）代表心功能；2)左室重构指标：舒张期/收缩期室间隔厚度（interventricular septal thickness at diastolic/systolic phase,IVSd/IVSs）、舒张期/收缩期左室内径（left ventricular internal diameter at diastolic/systolic phase, LVIDd/LVIDs）、舒张期/收缩期末期左室容积（left ventricle end-diastolic/systolic volume, LVVd/LVVs）,左室质量（left ventricular mass,LV mass）。4.荧光定量PCR分析ATP能量代谢相关基因mRNA表达水平；心肌组织ATP含量测定。5.组织学及蛋白质印迹检测：1) 电镜观察心肌超微结构改变；2)心肌组织学检测：HE染色、免疫组化；3) Western Blot检测心肌蛋白质聚集；6. 心肌自噬水平检测及相关机制的研究：1) 电镜观察心肌自噬体数量；2) Western Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、hVps34,Bcl-2、p-ERK/ERK;3) TUNEL检测心肌凋亡。结果：1.根据Hsp27表达水平的高低,将转基因小鼠分为两个转基因系,表达量较高的Tg10转基因系、表达量中等的Tg85转基因系。2.与野生型鼠相比,高表达Hsp27的转基因小鼠的心脏重／体重比（HW/BW）、心脏重/胫骨长比（HW/TL）增高；二尖瓣平面心脏肥大；而野生型小鼠和低度表达Hsp27的转基因小鼠HW/BV及HW/TL无统计学差异。3.与WT及Tg85小鼠相比,Tg10小鼠EF%及FS%明显降低（P<0.05或0.01）；IVSd（P<0.01）、LVIDd（P<0.05）、LVIDs（P<0.01）、LVVd（P<0.01）、LVVs（P <0.01）、LV mass （P<0.01）。4.逆转录PCR检测线粒体能量代谢基因mRNA水平,明显低于WT（P<0.01或0.05）。5.电镜结果显示,Tg10鼠心肌纤维、Z线及线粒体片状消失；石蜡切片HE染色和免疫组化证实,Tg10小鼠心肌细胞内大量蛋白质聚集；Western blot结果显示ibquitin、vimentin蛋白表达量增多（P<0.05）。6.电镜可见Tg10组心肌自噬体增多。与WT相比,Tg10 LC3Ⅱ/Ⅰ、 hVps34高于WT,P62低于WT（P<0.01或0.05）,Bcl-2显著下调（P<0.01）, p-ERK显著升高TUNEL检测心肌凋亡两组之间无显著性差异。结论：心肌特异性高表达Hsp27致心肌病,诱导心功能不全,原因可能至少部分是,自噬过渡激活所致,对心肌组织产生损伤性作用,最终导致心功能不全。