小麦脱水应答转录因子（DREB）基因的扩增、克隆及序列分析

论文摘要

植物的生长在很大程度上都受到外界环境的影响。因此,造成缺水胁迫的环境因子,如干旱、高盐和极端的温度就成为了限制农业生产的主要因素。随着全球日益膨胀的人口数,培育具有更多耐受胁迫的作物显得十分必要。但是由于植物抗逆性状本身的复杂性及其与数量性状位点连锁关系的复杂性,采用传统的育种方法已不太容易获得优良品种。植物中存在的众多转录因子中有相当一部分与植物的抗逆性有关,而DREB（Dehydration Responsive Element Binding）基因元件的发现是近年来植物抗逆研究方面最具突破性的进展。DREB转录因子受逆环境胁迫诱导产生后,可激活其他多达12个的依赖DRE顺式作用元件的抗逆功能基因,如rd29A、cor15a、rd17,并能引起脯氨酸及蔗糖含量的提高,从而使得植株多方面的抗逆性得以提高,这就比转化单个抗逆基因获得部分抗逆性要有效得多。 根据已有文献报道,DREB基因中不含内含子。提取小麦基因组DNA,根据已发表的黑麦DREB基因的保守序列设计了两对引物,经PCR扩增,分别获得一条长为292bp的片段和一条161bp的片段,克隆并测序。经BLASTn比对后发现292bp的片段与一个大麦DREB基因有90%的同源性。该片段已在GenBank上登录,登录号为gi|37963459;另一条161bp的片段与一个大麦DREB基因gi|12658318有85%的同源性。由于扩增这两个片段的两对引物在设计时有部分是重叠的,所以可将该两个片段进行拼接。再根据该拼接片段序列设计引物,提取4℃冷胁迫2小时的小麦黄化苗总体RNA,做cDNA3’末端快速扩增（3’RACE）,获得了该基因的3’端。将上述拼接片段与3’RACE片段拼接后全长为692bp,BLASTn分析的结果表明它与一个大麦CBF-like基因（gi|12658318）有87%的同源性。 将此692bp的片段作为被检EST序列进行BLAST检索,组装重叠群,重复进行该过程直至没有更多的重叠EST检出。我们获得了全长的基因编码序列。将该全长序列进行BLASTn比对,分析的结果表明它与大麦CBF1-like基因（gi|12658318）有88%的同源性。从EST序列着手进行电子克隆为我们提供了一种新的思维和工作模式,为从实验途径克隆获得全长cDNA序列奠定了重要的基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 植物中的转录因子与抗逆性
• 1.2 植物中的抗逆转录因子信号转导途径
• 1.3 植物抗逆研究中的方法技术进展
• 1.4 本工作的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小麦京411基因组DNA的提取步骤
• 292和WtJ₁₆₁)的PCR扩增'>2.2.2 小麦京411 DREB基因片段(WtJ₂₉₂和WtJ₁₆₁)的PCR扩增
• 292片段的PCR扩增'>2.2.2.1 WtJ₂₉₂片段的PCR扩增
• 292片段的PCR产物纯化回收'>2.2.2.2 WtJ₂₉₂片段的PCR产物纯化回收
• 2.2.2.3 小麦京411DREB基因片段gi|37963459的二次PCR扩增（re—PCR）
• 2.2.2.4 扩增片段的克隆
• 2.2.2.5 测序及序列分析
• 161片段的PCR扩增'>2.2.2.6 WtJ₁₆₁片段的PCR扩增
• 161片段的PCR产物纯化回收'>2.2.2.7 WtJ₁₆₁片段的PCR产物纯化回收
• 2.2.2.8 扩增片段的克隆
• 2.2.2.9 测序及序列分析
• 4263’末端的快速扩增'>2.2.3 WtJ₄₂₆3’末端的快速扩增
• 2.2.3.1 小麦总体RNA的提取
• 426片段3’末端的快速扩增'>2.2.3.2 WtJ₄₂₆片段3’末端的快速扩增
• 426片段的5’末端快速扩增（5RACE试剂盒法）'>2.2.4 WtJ₄₂₆片段的5’末端快速扩增（5RACE试剂盒法）
• 426片段的5’末端快速扩增（5RACE同聚物加尾法）'>2.2.5 WtJ₄₂₆片段的5’末端快速扩增（5RACE同聚物加尾法）
• 2.2.6 电子克隆小麦DREB基因全长
• 第三章 结果与分析
• 292（Wheat Jing411 292bp）片段的克隆、测序及序列分析'>3.1 WtJ₂₉₂（Wheat Jing411 292bp）片段的克隆、测序及序列分析
• 3.1.1 小麦总体DNA的提取
• 292片段的PCR扩增及克隆'>3.1.2 WtJ₂₉₂片段的PCR扩增及克隆
• 292片段的序列分析'>3.1.3 WtJ₂₉₂片段的序列分析
• 161（Wheat Jing411 161bp）片段的克隆、测序及序列分析'>3.2 WtJ₁₆₁（Wheat Jing411 161bp）片段的克隆、测序及序列分析
• 161片段的PCR扩增、二次扩增及克隆'>3.2.1 WtJ₁₆₁片段的PCR扩增、二次扩增及克隆
• 161片段的序列分析'>3.2.2 WtJ₁₆₁片段的序列分析
• 3.3.小麦DREB基因片段3末端的快速扩增（3’RACE）及克隆
• 3.3.1 小麦总体RNA的提取
• 3.3.2 小麦DREB基因片段3’末端快速扩增（3RACE）及克隆
• 3.3.3 小麦DREB基因片段5末端的快速扩增（5’RACE）、二次扩增及克隆
• 3.3.4 EST电子克隆获得小麦DREB基因全长序列
• 第四章 问题与讨论
• 4.1 引物设计
• 4.2 高质量的RNA是5RACE实验成功的保证
• 4.3 应用BLAST程序进行同源性分析
• 4.4 利用EST进行电子克隆
• 第五章 结论
• 第六章 参考文献