论文摘要
本研究从皮革厂、畜肉市场和屠宰场等处采样，分离得到49株具有明胶水解活性的微生物。菌株Col-C的培养液能在48h内对犊牛皮有明显消化作用，菌株Col-J则能完全消化。经形态学观察、生理生化培养和16S rDNA序列分析，鉴定菌株Col-C为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescen），菌株Col-J为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。以Ⅲ型酸性胶原蛋白为底物，菌株Col-C和菌株Col-J的胶原蛋白酶活性分别为21．19U／mL和35．97 U／mL。菌株Col-J培养液的活性凝胶电泳实验表明，该菌至少产生了3种具有胶原蛋白酶活性的同工酶。以短小芽孢杆菌Col-J为材料，进行胶原蛋白酶的分离纯化。发酵液离心去菌体，上清分别采用30％饱和度和75％饱和度的硫酸铵分级沉淀，沉淀溶解后，透析脱盐、浓缩。将样品过Sephadex G-100分子筛层析柱，收集活性峰S1。然后用过Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，收集活性峰Q3。SDS-PAGE检测表明，得到的电泳纯胶原蛋白酶，分子量约为58．64kD。结果表明，本实验对胶原蛋白酶的纯化倍数为31．53，回收率为7．00％。对纯化后的胶原蛋白酶进行酶学性质研究，结果表明：该酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH值为7．5。具有较强的耐热性，经30℃-65℃处理5min后仍能相对稳定，可保持在最高酶活的60％以上。经pH6-pH8．5的缓冲液处理30min后相对稳定，能保持在最高酶活的60％以上。离子影响实验表明，50mmol／L的Li+、K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和Ba2+对胶原蛋白酶具有一定的激活作用，而50mmol／L的Na+、Mn2+、Fe3+和Pb2+，以及0．01mmol／L的EDTA、EGTA和巯基乙醇则能抑制胶原蛋白酶的酶活。其中，Ca2+对酶的激活作用最强，相对酶活达到127％；而EGTA对酶的抑制作用最为强烈，相对酶活仅为10．1％。底物特异性实验表明，该酶对Ⅲ型酸性胶原蛋白具有较高的专一性。在pH7．5，45℃条件下，该胶原蛋白酶对酸性可溶胶原蛋白Ⅲ的米氏常数Km为0．79 mg/mL，最大反应速度Vmax为0．1295mg/（min·mL）。与已有报道的胶原蛋白酶性质比较表明，从短小芽孢杆菌Col-J分离纯化的该酶是一种新的胶原蛋白酶。