采用非标记定量技术对变形链球菌耐氟菌株的差异蛋白质组学研究

论文摘要

龋病是牙体硬组织的细菌感染性疾病,是最常见的口腔疾病,变形链球菌是其主要致病菌。氟化物作为目前使用最广泛的防龋制剂,对致龋菌的作用为氟防龋的重要机制之一。近年来,为提高并维持菌斑内较高氟水平,局部应用氟化物的浓度增加,间隔时间缩短,最可能的后果是耐氟菌株的产生。有报道国外学者从应用高浓度氟化钠凝胶防治猛性龋的患者口腔中分离出变形链球耐氟菌株；之后,又有学者从干燥症病人口腔中分离出变形链球菌耐氟菌株,这提示某些特殊人群的口腔中存在变形链球菌耐氟菌株。变形链球菌耐氟菌株产酸能力和耐酸性增强,致龋性较亲代菌株增强,并且耐氟菌株的基因组和蛋白质组均发生改变,但具体基因和蛋白还不能确定。虽然在正常人口腔中尚未分离出变形链球菌耐氟菌株,但氟化物的持续作用,体外耐氟菌株的诱导成功,都提示正常人群中亦可能产生耐氟菌株。耐氟菌株的出现,为氟化物防龋提出了新的问题,受到了国内外学者的密切关注,因而研究其发生、发展因素,对临床上合理应用氟化物及寻找新的防龋药物具有重要意义。本课题组的前期研究发现,变形链球菌耐氟菌株的ffh、dgk和dltc等耐酸相关基因较亲代菌株有不同程度的突变,但对耐酸相关基因编码蛋白的研究还比较缺乏。已有研究表明,仅有约2%的疾病与基因序列有关,而98%的疾病与蛋白表达密切相关。基因是遗传信息的携带者,而执行这些信息所蕴藏的生物学功能的是蛋白质,基因的表达产物蛋白质是生理功能的执行者,我们对蛋白质的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。发挥生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的,并不象基因组那样基本固定不变。同一细胞、同一组织、同一器官在不同的生理条件和不同的外界环境影响下,蛋白质的存在状态并不完全相同；病理状态下的细胞蛋白质组与正常生理条件下的也有所不同,这就需要通过差异蛋白质组学技术来进行研究。差异蛋白质组学是针对不同空间、不同时间上动态变化着的蛋白质组的整体进行比较,分析不同蛋白质组之间蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异,研究差异蛋白质及其功能。由于蛋白质自身具有的多样性、可变性和构象的复杂性等特点,使得蛋白质研究技术难度非常大,蛋白质组学研究能否成功,相当程度上取决于其技术水平的高低。差异蛋白质组学并不要求鉴定“全部”蛋白,而主要是找出有意义的差异蛋白,所以在技术上相对容易实现。对蛋白质在不同状态,不同环境,不同处理等情况下表达量的变化进行检测,这就需要用到蛋白质组学的定量技术。定量技术是整个蛋白质组学的精华部分,这种定量通常不必检测蛋白质在细胞内的绝对含量,而只需对其相对含量进行定量即可。定量蛋白质组学是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系内所有的蛋白质进行精确定量和鉴定的一门学科,这标志着蛋白质组学研究已从对蛋白质简单的定性向精确的定量方向发展。蛋白质组学研究中应用的定量方法主要有两种,一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量,另外一种是基于质谱检测技术的定量,包括标记定量技术（Labeling quantitation）和非标记定量技术（Label-free quantitation）两种。基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量,此方法由于双向凝胶电泳本身的限制,不能对蛋白质实现绝对分离,不能有效检测出具有极端等电点的、分子质量太大和太小的蛋白质以及低丰度的蛋白质和膜蛋白,因而逐渐有被基于质谱的蛋白质组学非标记定量技术代替的趋势。从原理上看,标记定量技术的主要策略是对要比较的样本的蛋白质或者肽段分别进行轻和重的稳定同位素标记,从而使他们的分子量具有一定的差异,酶解后的肽段同时进行质谱分析,根据质谱上成对出现的轻重同位素峰的强度进行相对定量。非标记定量技术,未对研究样本进行标记,样本酶解产物分别进行质谱分析,然后根据峰面积或者肽段总次数对肽段和蛋白质进行相对定量。非标记定量技术（Label-free quantitation）不需要昂贵的同位素标签做内部标准,实验耗费低；对样本的操作也最少,从而使其最接近原始状态；并且不受样品条件的限制,克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷,因此它在定量蛋白质组学研究中受到了众多科学工作者的推崇,得到了越来越广泛的应用。目前,已经有一系列配套的非标记定量分析软件,其中包括本研究采用的GE公司开发的DeCyder MSTM,具有很好的定量准确性和可信性。DeCyder MSTM软件对液相色谱串联质谱数据非标记定量分析是将质谱数据由谱峰形式转化为直观的类似双向凝胶的图谱,谱图上每一个点代表一个肽段,而不是蛋白质；再比较不同样本上相应肽段的强度,从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。本研究通过基于质谱的蛋白质组学非标记定量技术,利用液相色谱串联质谱和GE公司开发的DeCyder MSTM软件分析联用研究变形链球菌（UA159）耐氟菌株及其亲代菌株的蛋白质表达差异,发现并鉴定了明显差异蛋白67种,蛋白表达上调的为24种,蛋白表达下调的有43种。这些明显差异蛋白包括部分致龋毒力因子,其中与粘附有关的2种,为葡萄糖基转移酶和细胞表面粘附素PAC；与产酸相关的一种,为乳酸脱氢酶；与耐酸相关的4种,为F-ATP酶β-亚单位、信号识别颗粒蛋白质亚单位Ffh、分子伴侣DnaK和伴侣蛋白GroEL。同时应用GO （Gene Ontology）工具对差异蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞定位分析,并构建了变形链球菌耐氟菌株和其亲代菌株的差异蛋白质数据库。本研究的创新性体现在,首次应用蛋白质组学非标记定量技术对变形链球菌（UA159）耐氟菌株及其亲代菌株进行差异蛋白质组学研究,利用GE公司开发的DeCyder MSTM软件,并结合NCBI链球菌蛋白数据库,发现并鉴定了明显差异蛋白67种。同时构建了变形链球菌耐氟菌株和其亲代菌株的差异蛋白质数据库,为以后进一步研究变形链球菌和变形链球菌耐氟菌株致龋毒力因子相关基因及其编码的蛋白的功能打下基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 第1章 引言
• 第2章 文献综述
• 2.1 差异蛋白质组学研究进展
• 2.1.1 蛋白质组学研究的主要内容
• 2.1.2 蛋白质组学研究的策略
• 2.1.3 差异蛋白质组学概念
• 2.1.4 差异蛋白质组学主要研究技术
• 2.1.5 结束语
• 第3章 实验
• 3.1 变形链球菌耐氟菌株差异蛋白质组学分析
• 3.1.1 材料和方法
• 3.1.2 结果
• 3.1.3 讨论
• 3.2 变形链球菌耐氟菌株差异蛋白质数据库的构建
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 查询结果及分析
• 3.2.3 查询系统实现技术讨论
• 第4章 结论
• 参考文献
• 附录
• 作者简介及攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢