游离胆固醇对胰岛β细胞毒性及其分子机制研究

论文摘要

临床上2型糖尿病患者经常伴随高胆固醇血症。本研究利用胰岛β细胞株MIN6,考察了游离胆固醇对MIN6细胞的毒性作用。胆固醇的暴露诱导了MIN6细胞产生细胞凋亡,且这种作用方式具有时间和剂量依赖性的特点。甲基-β-环糊精的添加从细胞质膜上去除了胆固醇,并且使细胞免于胆固醇诱导的细胞凋亡。Western Blot结果显示胆固醇施加后p38丝裂原活化蛋白激酶（P-p38 MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（P-JNK）的磷酸化水平显著增加,暗示应激活化蛋白激酶（SAPKs）信号通路被激活。特异性的p38抑制剂SB205830挽救了MIN6细胞免于胆固醇诱导产生的凋亡,但是JNK抑制剂SP600125没有这个效果,暗示胆固醇的施加特异性地活化了p38信号通路。内质网应激标记蛋白Bip和CHOP的表达没有受到影响,暗示在胆固醇诱导的β细胞凋亡中没有内质网应激的参与。利用活性氧荧光标记法测定细胞内活性氧（ROS）浓度的结果显示,在胆固醇施加后细胞内ROS水平显著增加,证明胆固醇诱导产生的氧化应激直接导致了细胞凋亡。综上,这些结果证明游离胆固醇通过介导氧化应激和活化p38 MAPK信号通路诱导MIN6细胞产生凋亡。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 0.1 胆固醇
• 0.2 细胞凋亡
• 0.3 氧化应激
• 0.4 内质网应激及内质网应激与β胰岛细胞功能的关系
• 0.5 MIN6 细胞
• 0.6 SDS-PAGE 电泳
• 0.7 免疫印迹法
• 0.8 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）
• 0.9 TUNEL 的原理及应用
• 0.10 研究背景及意义
• 第1章 游离胆固醇施加对 MIN6 细胞的细胞毒性的研究
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂盒
• 1.3 实验使用仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 MIN6 细胞体外传代培养及保种
• 1.4.2 anti-rabbit active caspase 3 免疫荧光
• 1.4.3 TUNEL 方法检测细胞凋亡
• 1.4.4 小鼠胰岛素含量测定方法
• 1.4.5 胆固醇含量测定
• 1.5 结果与讨论
• 1.5.1 胆固醇施加诱导MIN6 细胞凋亡
• 1.5.2 胆固醇的去除阻止了胆固醇负荷诱导的MIN6 细胞的凋亡
• 1.6 结论
• 第2章 游离胆固醇对 MIN6 细胞毒性的细胞信号转导研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 抗体
• 2.3 实验使用仪器
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 制作蛋白标准曲线及测量待测样品浓度
• 2.4.2 Western blot
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 Western blot 方法检测SAPKs 的磷酸化水平
• 2.5.2 SAPK 抑制剂在挽救细胞免于胆固醇施加诱导的细胞凋亡产生的效应
• 2.5.3 内质网应激通路在胆固醇诱导的细胞凋亡未活化
• 2.5.4 胆固醇施加到MIN6 细胞后活化的和磷酸化的Akt（P-Akt）的变化
• 2.6 结论
• 第3章 游离胆固醇施加对 MIN6 细胞活性氧水平影响的研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验使用仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 DCFHDA 测定细胞内ROS
• 3.4 结果与讨论
• 3.5 结论
• 第4章 结果与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况