中国葡萄炭疽病病原菌的鉴定及种群分化的研究

论文摘要

葡萄是我国重要的栽培果树之一。葡萄病害严重影响葡萄的产量和品质。近年来,葡萄炭疽病发病情况日趋严重。本论文对我国北京、山东,河北等7个省市葡萄产区炭疽病发生情况进行了调查并采集病样,分离得到135个单孢菌株,对病原菌的种类和致病力差异进行了研究,结果如下:1调查了我国北京、山东,河北、河南等4省市葡萄种植区炭疽病的发病情况。调查结果显示,在北京,山东、河北等地,炭疽病普遍发生,严重的葡萄园病果率达到55%。酿酒葡萄发病严重,鲜食葡萄套袋栽培发病很轻,病穗率最高仅为5.5%。2从北京、山东,河北、河南、广西、新疆等7个省市进行病样采集,分离得到葡萄炭疽病菌80株,单孢系135株。通过菌落形态,分生孢子形态、大小,分生孢子梗及分生孢子盘等形态特征以及rDNA ITS序列分析,135个菌株均为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.)。3根据致病力测定,并结合菌落形态、产孢量、生长速率等生物学特性,发现分离的胶孢炭疽菌在种内存在分化现象。据此,将分离的胶孢炭疽菌划分为三个类型:类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ。4利用AFLP分子标记技术对三个类型进行分子标记研究。以三个类型的典型菌株为试验菌株,从64对AFLP随机引物组合中筛选出16对具有组间多态性位点较多的引物组合。16对引物共扩增出1059条带,其中,多态性条带489条,多态性比率为32.41%。说明这三个类型的菌株在分子水平上也存在差异:从三个类型中随机选取20株,对筛选出的AFLP随机引物组合E13/M14进行验证,扩增结果通过离差平方和法聚类分析发现,有17株的AFLP分子标记分组与形态学分组划分相符,一致性达85%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 葡萄炭疽病的危害
• 1.2 葡萄炭疽病的症状
• 1.3 葡萄炭疽病的病原
• 1.4 炭疽菌属的确立及分类地位
• 1.5 胶孢炭疽菌
• 1.5.1 胶孢炭疽菌形态特征和生物学特性
• 1.5.2 胶孢炭疽菌的分类状况
• 1.6 分子标记技术在生物学上的应用
• 1.6.1 主要的分子标记学方法
• 1.6.2 分子标记在炭疽菌研究上的应用
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 葡萄炭疽病的发生与危害调查
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 调查地点
• 2.1.2 调查方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 山东胶东半岛葡萄炭疽病发生危害情况
• 2.2.2 北京葡萄炭疽病发生危害情况
• 2.2.3 河北葡萄炭疽病发生危害情况
• 2.2.4 河南葡萄炭疽病发生危害情况
• 2.3 讨论
• 3 葡萄炭疽病病原菌分离与鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 培养基、酶及主要生化试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 病样的采集
• 3.1.4 病原菌的分离
• 3.1.5 Koch’s 法则验证
• 3.1.6 分生孢子形态的观察
• 3.1.7 附着胞形态的观察
• 3.1.8 全基因组DNA 的制备（SDS 法）
• 3.1.9 PCR 引物
• 3.1.10 PCR 反应体系与反应程序
• 3.1.11 DNA 片段的回收与纯化
• 3.1.12 DNA 片段的连接
• 3.1.13 目的片段的E. coli 转化
• 3.1.14 E. coli 质粒 DNA 的提取方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 葡萄炭疽病样本的采集
• 3.2.2 病原菌分离
• 3.2.3 Koch's 法则验证
• 3.2.4 病原菌鉴定
• 3.3 讨论
• 4 葡萄胶孢炭疽菌的致病力分化研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 供试葡萄品种
• 4.1.3 菌落形态的观察
• 4.1.4 温度对病原菌生长的影响
• 4.1.5 产孢量的测定
• 4.1.6 致病力的测定
• 4.1.7 葡萄果实抗性的分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 胶孢炭疽菌生物学特性研究
• 4.2.2 胶孢炭疽菌的三个类型的菌株分布
• 4.3 讨论
• 5 葡萄胶孢炭疽菌不同组间的 AFLP 分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试菌株
• 5.1.2 培养基、酶及常用生化试剂
• 5.1.3 AFLP 接头序列
• 5.1.4 病原菌全基因组DNA 的提取
• 5.1.5 胶孢炭疽菌全基因组DNA 双酶切
• 5.1.6 双酶切产物的接头连接
• 5.1.7 PCR 反应体系与反应程序
• 5.1.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 5.1.9 银染检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 葡萄胶孢炭疽菌全基因组 DNA 的质量检测
• 5.2.2 AFLP 引物组合的筛选
• 5.2.3 AFLP 指纹图谱
• 5.2.4 胶孢炭疽菌的聚类分析
• 5.3 讨论
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介