水稻bsl基因的功能及其在杂交水稻混播制种中的应用

论文摘要

苯达松为苯并噻二唑类除草剂,可抑制杂草的光合作用,用于农田除草。野生型水稻（Oryza sativa L.）品种具有苯达松的抗性,可将苯达松快速代谢为羟基化的失活产物。水稻品种（‘N8’和‘W6154s’）经辐射诱变获得了对苯达松极其敏感的突变体,研究表明其敏感致死表型由单个bsl基因控制。bsl基因作为一个化学致死标记,在水稻杂交制种中有广阔的应用前景,主要体现在以下两方面:一是将bsl基因转育到三系恢复系,可实现杂交水稻混播制种;二是将bsl基因转育到不育系,可确保水稻杂种纯度。为了验证bsl基因的功能,为该基因在农业生产上应用提供理论依据,本文开展了水稻苯达松抗性差异的生理基础和水稻微粒体蛋白质组学等方面的研究。开展了施药对恢复系花粉活力的影响、苯达松致死剂量与环境因子的关系以及苯达松农田残留等方面的研究。并利用研究成果进一步完善杂交水稻混播制种技术,加速其应用的步伐。首先,我们以野生型水稻品种‘农林8号’（‘N8’）和‘W6154s’及相应的bsl突变体（‘农林8号m’（‘N8m’）和‘8077s’）为材料,分析了苯达松处理前后叶绿素（Chl）含量、丙二醛（MDA）含量、净光合速率（An）、叶绿素荧光参数及体内苯达松含量等生理生化指标的变化及水稻苯达松抗性差异的生理机制。结果表明:两个bsl水稻品种在苯达松处理后由于光合能力的丧失,进而引起氧自由基伤害的积累,最终导致Chl降解、质膜氧化加剧,植株死亡;Chl荧光参数的分析表明苯达松处理引起还原性QA组分积累,导致电子传递受阻是光合能力丧失的根源。在苯达松处理初期,野生型水稻品种及bsl突变体同样表现为光合能力丧失。但处理后2 h,野生型材料光合能力开始不断恢复,而bsl突变体无法恢复。体内苯达松含量分析表明,较强的苯达松代谢能力是抗性材料免受苯达松伤害的主要原因。为了寻找苯达松解毒相关蛋白,我们以‘N8’和‘N8m’为材料,通过优化条件,建立了适合于水稻微粒体蛋白的双向电泳技术。并通过双向电泳图谱的比对,共找到15个差异蛋白点,分为供试材料间差异、苯达松处理前后差异和‘N8’在苯达松处理后特异表达等3种类型。结合苯达松抗性比较及苯达松残留分析,推测材料间差异是因γ射线辐照引起基因结构变异,从而影响了基因的表达;苯达松处理前后差异与氧自由基清除酶系或系统获得抗性相关酶系有关;‘N8’在苯达松处理后特异表达与苯达松代谢有关。这为进一步开展bsl基因蛋白质组学研究奠定了基础。另外,我们通过对液体培养基中蔗糖、硼酸及钙离子浓度的优化选择,建立了适合水稻花粉离体萌发的液体培养基配方。并利用花粉萌发和碘.碘化钾（I2-KI）染色测定法,研究了苯达松对含敏感致死基因的恢复系‘Mc526’的花粉生活力的影响。结果显示,在苯达松处理前期（施药后1～4天）,Mc526花粉活力与对照接近,处理后期（施药后5～8天）略低于对照,但差异不显著。这为苯达松敏感致死基因应用于杂交水稻混播制种的可行性提供了生理依据。再者,我们以‘混制1号’恢复系‘Mc526’为材料,通过相关生理生化指标测定,比较了在不同光照、温度条件下苯达松伤害的差异,旨在为实际制种过程中合理调整施药浓度提供理论依据。温度对苯达松药效影响的研究表明:在21℃～36℃范围内,温度与苯达松药效呈显著正相关,即温度每增加1℃,苯达松致死浓度约下降74.09mg·L-1,药效约提高0.7%。生理生化研究表明,体内水分平衡失调引起水分胁迫和代谢旺盛引发氧自由基积累是高温下苯达松药效提高的主要原因。田间试验验证了温度对苯达松药效影响的室内研究结果。光强对苯达松药效影响的研究表明:强光(100μmol·m-2·s-1)和弱光(25μmol·m-2·s-1)条件下,苯达松药效较中光(50μmol·m-2·s-1)均有显著提高。相关生理生化研究证实,强光下氧自由基胁迫增加是苯达松药效加强的主要原因。最后,我们建立了苯达松、6-OH-苯达松和8-OH-苯达松高效液相色谱同柱分析方法。同时利用该方法,对杂交水稻‘混制1号’制种田苯达松最终残留和消解动态进行研究,对杂交水稻混播制种技术应用引起环境威胁的可能性进行科学评估。结果表明:不育系稻谷和稻秆、制种田土样中苯达松残留量均低于最低检测浓度,而恢复系稻谷和稻秆中苯达松残留量较大。土壤中苯达松消解动态分析表明,苯达松在土壤中的消解速度较快。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 苯达松除草机理及其代谢
• 1.1.1 除草剂对敏感植物的作用
• 1.1.2 植物对除草剂的选择抗性
• 1.1.3 细胞色素P450在植物除草剂抗性中的作用
• 1.2 水稻苯达松敏感致死突变体的发现及其应用
• 1.2.1 水稻苯达松敏感致死突变体的发现
• 1.2.2 水稻bsl基因在水稻杂交制种中的应用
• 1.3 水稻bsl基因的研究进展
• 1.3.1 水稻bsl基因的定位
• 1.3.2 水稻bsl基因的克隆及功能分析
• 1.4 杂交水稻混播制种技术研究进展
• 1.4.1 杂交水稻常规制种和混播制种的比较
• 1.4.2 杂交水稻混播制种研究进展及存在的问题
• 2 叶面施用苯达松对不同水稻品种的生理生化影响
• 2.1 试验材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.3 统计分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 水稻品种间苯达松抗性差异
• 2.2.2 处理叶片净光合速率的变化
• 2.2.3 处理叶片Chl荧光的变化
• 2.2.4 处理叶片Chl含量和MDA含量的变化
• 2.2.5 处理叶片超氧阴离子自由基含量及其清除酶活性的变化
• 2.2.6 苯达松的吸收与代谢
• 2.3 讨论
• 2.3.1 bsl突变体苯达松致死机理
• 2.3.2 野生型水稻苯达松抗性机理
• 3 适用于水稻微粒体蛋白的双向电泳技术及苯达松抗性相关蛋白的初步分析
• 3.1 试验材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 水稻微粒体蛋白双向电泳
• 3.1.3 图像分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 水稻微粒体蛋白质2-DE条件优化
• 3.2.2 苯达松处理前后微粒体蛋白2-DE图谱比对分析
• 3.3 讨论
• 4 苯达松对‘混制1号'恢复系‘Mc526'花粉活力的影响
• 4.1 试验材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.3 统计分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 水稻花粉培养基的优化
• 4.2.2 苯达松对‘Mc526'花粉活力的影响
• 4.2.3 苯达松对‘混制1号'父母本结实率的影响
• 4.3 讨论
• 5 不同光温条件下苯达松对‘混制1号'恢复系‘Mc526'伤害差异的研究
• 5.1 试验材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验设计
• 5.1.3 试验方法
• 5.1.4 统计分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 温度对苯达松药效的影响
• 5.2.2 光照强度对苯达松药效的影响
• 5.2.3 田间喷施苯达松‘Mc526'伤害程度的比较
• 5.3 讨论
• 6 ‘混制1号'制种田苯达松残留分析
• 6.1 试验材料与方法
• 6.1.1 材料及供试农药
• 6.1.2 田间试验设置
• 6.1.3 试验方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1.苯达松及其代谢产物同柱分析方法
• 6.2.2 苯达松在土壤中消解动态分析
• 6.2.3 最终残留分析
• 6.3 讨论
• 7 结论
• 7.1 水稻苯达松抗性差异的生理生化基础
• 7.1.1 bsl突变体苯达松致死的生理基础
• 7.1.2 野生型水稻苯达松抗性的生理基础
• 7.2 苯达松抗性相关蛋白的初步分析
• 7.2.1 水稻微粒体蛋白的双向电泳技术的建立
• 7.2.2 不同水稻品种间微粒体蛋白双向电泳图谱的比对
• 7.3 苯达松对敏感型水稻花粉活力的影响
• 7.3.1 水稻花粉培养基的优化
• 7.3.2 苯达松对‘Mc526'花粉活力的影响
• 7.4 光温条件对苯达松药效的影响
• 7.4.1 温度对苯达松药效的影响
• 7.4.2 光照强度对苯达松药效的影响
• 7.5 ‘混制1号'制种田苯达松残留分析
• 7.5.1 苯达松及其代谢产物的HPLC同柱分析方法
• 7.5.2 ‘混制1号'制种田苯达松最终残留及土壤消解动态分析
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 在读期间发表的学术论文