生物素化紫杉醇合成及人乳腺癌细胞株与紫杉醇耐药株蛋白质学差异分析

论文摘要

背景:紫杉醇是90年代起在临床上广为应用的一种抗癌新型药物,被用作治疗乳腺癌、卵巢癌等妇科癌症,并在其它多种癌症中广泛应用。但是肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药已经成为化疗成功的障碍。肿瘤细胞多药耐药（multidrug resistance,MDR）是肿瘤化疗失败的常见原因,虽然已有研究揭示了一些肿瘤MDR机制,但目前仍然不能完全解释MDR现象。目的:建立一步法合成生物素化紫杉醇的方法,寻找人乳腺癌紫杉醇耐药细胞株（MCF-7/Txl）与野生株差异的结合蛋白。方法1.以紫杉醇,生物素为底物,DCC脱水,DMAP,N2催化溶于无水二氯甲烷制备生物素化紫杉醇。2.用HPLC-MS法对所得的生物素化紫杉醇的化学合成反应液进行分析鉴定。3.MCF-7细胞与不同浓度生物素化紫杉醇共同培养后观察生长抑制率,计算IC50。4.将MCF-7细胞株和MCF-7/Txl细胞株细胞裂解液用标记有亲和苏的免疫磁珠-生物素化紫杉醇正选紫杉醇结合蛋白,并以SDS-PAGE分离、纯化5比较所得的差异蛋白序列分析,进行LC—MS/MS测序比对分析,以Westernblot法鉴定质谱法分析所得的差异结合蛋白。结果一步法化学催化合成反应产生副反应产物较少,目标产物纯度较高（>80%）。生物素化紫杉醇对MCF-7细胞的IC50为0.016mg/L。没有用生物素化紫杉醇包被的免疫磁珠在进行生物淘洗分离之后,在pH2.4的洗涤液中未出现条带。MCF-7和MCF-7/Txl的细胞裂解液经过包被了生物素化紫杉醇的磁珠免疫亲和层析法生物淘洗分离后,两株细胞全细胞裂解液经pH2.4缓冲液洗涤液均再次出现若干条带,而且MCF-7紫杉醇结合蛋白中有一条带在MCF-7/Txl紫杉醇结合蛋白中没有出现。Western blot法验证其中的差异条带中包含Heat shock proteinHSP 90α、Importinβ-1、tetrahydrofolate synthase、actinin-α-4、ubiquitin、Hornerin、Rho GTPase-activating protein等蛋白。结论1、一步法合成生物素化紫杉醇简便高效且不影响紫杉醇的生物学活性。2、乳腺癌细胞野生株MCF-7及紫杉醇耐药株MCF-7/Txl存在差异结合蛋白。3、差异蛋白中包含Importinβ-1,tetrahydrofolate synthase,actinin-α-4,ubiquitin,Hornerin,Rho GTPase-activating protein等蛋白。

论文目录

• 英文缩写索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 生物素化紫杉醇的合成制备及活性鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二部分 磁珠免疫亲和层析法筛选紫杉醇结合差异蛋白
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 差异结合蛋白的鉴定及分析
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述 紫杉醇耐药机制与逆转耐药的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 附录 在校期间发表论文