鸭肝炎病毒单克隆抗体的制备及ELISA病毒检测方法的建立

论文摘要

本试验应用易感鸭胚和鸭胚原代肝细胞培养1型鸭肝炎病毒（DHV-1）和新型鸭肝炎病毒（N-DHV）,制备病毒液;采用反复冻融释放病毒,氯仿去脂,0.22μm微孔滤膜过滤去除细菌和大分子杂质,透析法浓缩病毒,Sepharose CL-4B凝胶过滤纯化病毒的方法;获得了用于免疫小鼠制备脾细胞,免疫家兔制备多克隆抗体和间接ELISA检测的纯化抗原。使用纯化抗原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合乳化,制备免疫原;通过适当的免疫程序注射BALB/c小鼠,获得了血清抗体效价高的免疫小鼠,为制备免疫脾细胞奠定了基础。同时利用纯化抗原建立了筛选阳性克隆和测定鼠抗体效价的间接ELISA方法。应用常规技术将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用已建立的间接ELISA法,通过测定融合细胞分泌的抗体对DHV-1和N-DHV,以及健康鸭胚胚液的反应性,经过初筛和复检,筛选出5孔分泌对DHV-1和N-DHV阳性,对健康鸭胚胚液阴性的抗体的杂交瘤细胞。利用有限稀释法,经过5次亚克隆,扩大细胞培养和腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水抗体,获得了2株稳定分泌抗DHV-1和N-DHV抗体的杂交瘤细胞,分别命名为Ya4C7和Ga3B6。Ya4C7株细胞分泌单抗对2个血清型病毒的效价均为1:40;小鼠腹水单抗对N-DHV的效价大于1:100000,对DHV-1的效价为1:3200。Ga3B6株细胞分泌单抗对2个血清型病毒的均效价为1:20;小鼠腹水单抗对N-DHV的效价大于1:50000,对DHV-1的效价为1:6400。Ya4C7株单抗对2型抗原的亲和力大于Ga3B6株单抗。2个单抗均为IgGⅠ亚类且与其他鸭常见病原无交叉反应。使用辛酸-硫酸铵法提纯腹水单抗IgG和自制的高免兔血清中的IgG,经蛋白含量测定、SDS-PAGE电泳分析和效价测定表明,纯化后IgG的纯度和活性都明显提高。使用提纯的鼠单抗IgG包被酶标板,兔多抗IgG与病毒反应和羊抗兔IgG酶标物与之结合,建立了检测DHV-1和N-DHV的改良双夹心ELISA（AC-ELISA）检测法。该方法对N-DHV和DHV-1的最小检出量分别为12.6ng/mL和10.7ng/mL,对DPV等其他鸭病原的检测为阴性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 引言
• 1 概述
• 1.1 病原特性
• 1.1.1 理化特性
• 1.1.2 病毒增殖
• 1.1.3 病毒的变异
• 1.2 流行病学特点
• 1.3 诊断方法
• 1.3.1 临床症状及病理特征
• 1.3.2 病毒的分离
• 1.3.3 电镜观察
• 1.3.4 中和试验
• 1.3.5 血凝试验
• 1.3.6 琼脂免疫扩散试验
• 1.3.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.3.8 免疫胶体金诊断技术
• 1.3.9 其他免疫学方法
• 1.3.10分子生物学诊断技术
• 1.4 预防
• 1.5 治疗
• 1.6 鸭肝炎病毒的纯化
• 1.7 单克隆抗体技术在DHV检测方面优势及应用
• 2 目的意义
• 3 研究设想
• 第一章 DHV抗原的制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒
• 1.1.2 抗血清
• 1.1.3 实验鸭胚和实验鸭
• 1.1.4 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 鸭胚半数致死量（DELD50）的测定
• 1.2.2 交叉中和试验
• 1.2.3 病毒液制备
• 1.2.4 病毒纯化
• 1.2.5 蛋白质浓度的测定
• 1.2.6 纯化病毒的检测
• 2 结果
• 2.1 病毒对鸭胚的毒力
• 2.2 病毒对鸭胚原代肝细胞（DELC）的致细胞病变特性
• 2.3 病毒液病毒含量测定
• 2.4 病毒液特异性鉴定
• 2.5 病毒纯化
• 2.6 纯化病毒的检测
• 3 讨论
• 3.1 鸭肝炎病毒的培养
• 3.2 中和试验
• 3.3 鸭肝炎病毒的纯化
• 第二章 DHV单克隆抗体的制备
• 1 材料
• 1.1 病毒
• 1.2 实验动物
• 1.3 细胞
• 1.4 阳性血清
• 1.5 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 间接ELISA方法
• 2.2 BALB/c小鼠的免疫
• 2.3 细胞融合
• 2.3.1 饲养细胞的制备
• 2.3.2 SP2/0 骨髓瘤细胞复苏与扩大培养
• 2.3.3 免疫脾细胞制备
• 2.3.4 融合
• 2.4 阳性孔的筛选
• 2.5 杂交瘤阳性细胞的克隆化
• 2.6 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.7 腹水抗体的制备及纯化
• 2.7.1 腹水抗体的制备
• 2.7.2 单克隆抗体的纯化
• 2.7.3 单克隆抗体的纯化鉴定
• 2.8 单克隆抗体的鉴定
• 2.8.1 染色体检查
• 2.8.2 单克隆抗体效价的测定
• 2.8.3 MAb的相对亲和力的测定
• 2.8.4 单克隆抗体特异性鉴定
• 2.8.5 单克隆抗体亚型的鉴定
• 2.8.6 稳定性观察
• 3 结果
• 3.1 间接ELISA方法最佳条件的确定
• 3.1.1 最适抗原包被浓度和酶标二抗工作浓度的确定
• 3.1.2 阳性对照血清最佳稀释度确定
• 3.1.3 阴阳性临界值确定
• 3.2 免疫小鼠抗体效价
• 3.3 细胞融合及亚克隆
• 3.4 腹水单抗制备及抗体纯化
• 3.5 杂交瘤细胞株染色体的鉴定
• 3.6 杂交瘤细胞细胞培养上清液效价及其腹水效价测定
• 3.7 单克隆抗体亲和力测定
• 3.8 单抗与二型DHV及其他鸭病原反应鉴定
• 3.9 单抗亚类的鉴定
• 3.10杂交瘤细胞株稳定性鉴定
• 4 讨论
• 4.1 抗原的要求
• 4.2 小鼠免疫
• 4.3 建立筛选方法
• 4.4 单克隆抗体的制备
• 第三章 DHV单克隆抗体的初步应用--改良双夹心ELISA （AC-ELISA）方法的建立
• 1 材料
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒
• 1.1.2 血清
• 1.1.3 动物
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 多克隆抗体的制备与纯化
• 2.1.1 多克隆抗体的制备
• 2.1.2 多克隆抗体的纯化
• 2.1.3 纯化的多克隆抗体的鉴定
• 2.2 改良双夹心ELISA方法的建立
• 2.2.1 鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体最佳工作浓度的确定
• 2.2.3 封闭液和封闭时间的选择
• 2.2.4 反应程式的确定
• 2.2.5 临界点的确定
• 2.3 特异性试验
• 2.4 检测的灵敏度的测定
• 2.5 重复性试验
• 3 结果
• 3.1 兔高免血清效价
• 3.2 纯化兔抗体的鉴定
• 3.2.1 活性测定
• 3.2.2 纯度鉴定
• 3.2.3 蛋白含量测定
• 3.3 改良双夹心ELISA方法最佳条件的确定
• 3.3.1 鼠单抗与兔多抗最佳工作浓度的确定
• 3.3.2 封闭液与封闭时间的确定
• 3.3.3 反应程式的确定
• 3.3.4 临界值的确定
• 3.3.5 改良双夹心ELISA操作术式
• 3.4 ELISA检测的特异性
• 3.4.1 特异性阻断试验鉴定
• 3.4.2 AC-ELISA方法的反应性
• 3.5 ELISA检测的灵敏度
• 3.6 ELISA检测的可重复性
• 4 讨论
• 第四章 结论及下步工作设想
• 1 结论
• 2 下步工作设想
• 参考文献
• 附录一 溶液配制
• 附录二 仪器设备
• 致谢
• 作者简介