丙酮酸乙酯对脓毒症肺损伤的保护作用及其机制的研究

论文摘要

第一部分丙酮酸乙酯对大鼠脓毒症肺损伤的保护效应目的观察丙酮酸乙酯对脓毒症肺损伤大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响,探讨丙酮酸乙酯治疗脓毒症肺损伤的机制。方法采用盲肠结扎穿孔方法复制脓毒症肺损伤模型,40只Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组、脓毒症肺损伤组和丙酮酸乙酯（40mg/kg,每隔6小时腹腔内注射一次）治疗组,每组10只。用ELISA法检测2h血清TNF-α、IL-1β表达。所有大鼠24h后放血处死,采集血液和肺组织标本。用RT-PCR方法检测肺组织iNOS mRNA的表达,采用硝酸盐/亚硝酸盐分光法测血清一氧化氮（NO）浓度,测定PaO2、PaCO2和pH等血气变化,观察肺组织的病理变化。结果脓毒症肺损伤组血清TNF-α、IL-1β分别升高为335.0±52.4 pg/ml、811.0±82.9 pg/ml（P<0.01）;肺组织iNOS mRNA表达显著增高（P<0.01）;血清NO浓度升高为150.8±28.7μmol/L（P<0.01）;PaO2、pH降低,PaCO2升高（P<0.01）;病理显示明显肺损伤（P<0.01）。丙酮酸乙酯治疗后血清TNF-α、IL-1β分别下降为115.9±16.4 pg/ml、491.8±61.3 pg/ml（P<0.01）;iNOS mRNA的表达显著下调（P<0.01）,血清NO浓度下降为105.6±23.2μmol/L（P<0.01）;PaO2、pH升高,PaCO2降低（P<0.01）,病理显示肺损伤程度减轻（P<0.01）。结论丙酮酸乙酯能显著抑制TNF-α、IL-1β等炎症因子,下调由iNOS表达增强而诱导生成的NO水平,改善低氧血症,对脓毒症肺损伤有明显保护作用。第二部分丙酮酸乙酯对脓毒症肺损伤大鼠高迁移率族蛋白-1表达的影响目的观察丙酮酸乙酯对脓毒症肺损伤大鼠高迁移率族蛋白-1（HMGB1）表达的影响,探讨丙酮酸乙酯治疗脓毒症肺损伤的分子机制。方法采用盲肠结扎穿孔方法复制脓毒症肺损伤模型,40只Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组、脓毒症肺损伤组和丙酮酸乙酯（40mg/kg,腹腔内注射）治疗组,每组10只。所有大鼠24h后放血处死,收集支气管肺泡灌洗液、血液和肺组织标本。用RT-PCR方法检测肺组织HMGB1mRNA的表达,采用免疫组织化学和Western blot方法检测肺组织HMGB1蛋白的表达,测定肺湿/干重比、支气管肺泡灌洗液蛋白含量并计算肺泡通透指数,光学显微镜下观察肺组织的病理变化。结果与正常对照组比较,脓毒症肺损伤组HMGB1mRNA表达升高为0.81±0.09（P<0.01）;western blot分析HMGB1蛋白表达强度升高至5.04倍（P<0.01）;免疫组织化学检测HMGB1强阳性表达,主要分布于肺泡上皮和间质上皮细胞、小支气管粘膜上皮细胞、肺泡和间质大量的炎性细胞;肺湿/干重比、支气管肺泡灌洗液蛋白含量和肺泡通透指数升高（P<0.01）;病理显示肺损伤程度重。丙酮酸乙酯治疗后肺组织HMGB1mRNA表达为0.38±0.03（P <0.01）;western blot分析HMGB1蛋白表达强度为正常对照组的1.93倍（P<0.01）;免疫组织化学检测肺组织HMGB1阳性表达减轻（P<0.01）;肺湿/干重比、支气管肺泡灌洗液蛋白含量和肺泡通透指数均较脓毒症肺损伤组明显下降;病理显示肺损伤减轻。肺组织HMGB1mRNA表达、western blot分析HMGB1蛋白表达强度分别与肺湿/干重比、支气管肺泡灌洗液蛋白含量和肺泡通透指数呈显著正相关（P<0.01）。结论丙酮酸乙酯能显著抑制HMGB1的表达,对大鼠脓毒症肺损伤有明显保护作用。第三部分丙酮酸乙酯对脓毒症肺损伤大鼠JAK2-STAT3信号通路的影响目的研究丙酮酸乙酯对脓毒症肺损伤大鼠肺组织的JAK2和STAT3的活化程度的影响及意义。方法采用盲肠结扎穿孔方法复制脓毒症肺损伤模型,48只Wistar大鼠,随机分为6组,每组8只:正常对照组、假手术组、脓毒症肺损伤组、丙酮酸乙酯治疗组、AG490处理组、雷帕霉素处理组。所有大鼠24h后放血处死,收集支气管肺泡灌洗液和肺组织标本。用免疫组织化学测定肺组织磷酸化STAT3的表达和定位,Western Blot分析JAK2和STAT3蛋白磷酸化活化程度,支气管肺泡灌洗液白细胞计数,测定肺湿/干重比,测定肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性,同时观察肺组织病理形态改变。结果与正常对照组比较,脓毒症肺损伤组肺组织磷酸化STAT3强阳性表达,遍布于肺泡上皮和间质上皮细胞、肺泡和间质大量的炎性细胞,多位于细胞核部分;磷酸化JAK2和STAT3蛋白表达升高（P <0.05）;支气管肺泡灌洗液白细胞计数、肺湿/干重比和肺组织MPO活性增高（P <0.01）;同时病理形态反映肺损伤程度重。丙酮酸乙酯治疗后,磷酸化JAK2蛋白表达明显减少（P <0.05）。丙酮酸乙酯、AG490、雷帕霉素分别处理后,肺组织磷酸化STAT3表达减轻,只有少部分上皮细胞和炎性细胞呈弱阳性表达;Western Blot分析磷酸化STAT3蛋白表达明显减少（P <0.05）;支气管肺泡灌洗液白细胞计数、肺湿/干重比和肺组织MPO活性降低（P <0.01）;病理检查肺损伤程度明显减轻,三者程度基本相同。结论丙酮酸乙酯可调节JAK2-STAT3磷酸化活性,减轻脓毒症所致急性肺损伤,其程度与JAK2和STAT3特异性抑制剂相同。第四部分丙酮酸乙酯对内毒素刺激肺泡巨噬细胞的作用研究目的研究丙酮酸乙酯对内毒素刺激肺泡巨噬细胞（AM）肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、高迁移率族蛋白-1（HMGB1）及JAK2-STAT3信号转导通路的影响,在细胞水平探讨丙酮酸乙酯抗脓毒症肺损伤作用的可能机制。方法以丙酮酸乙酯（5mmol/L）作用于肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR方法检测LPS（100 ng/ml）刺激2h后TNF-αmRNA的表达;Western Blot检测LPS刺激24h后培养基中HMGB1的表达,及AM中JAK2、磷酸化JAK2、STAT3、磷酸化STAT3的表达;免疫细胞化学法分析LPS刺激24h后AM中磷酸化STAT3的程度和定位。结果与对照组比较,LPS作用于AM后,TNF-αmRNA（P<0.01）、HMGB1 （P<0.01）、磷酸化JAK2 （P<0.05）和磷酸化STAT3 （P<0.05）表达增加,巨噬细胞胞浆和胞核磷酸化STAT3表达呈强阳性,其中胞核浓染程度更高,胞核阳性染色细胞百分比升高（P<0.05）。丙酮酸乙酯治疗后,TNF-αmRNA（P<0.01）、HMGB1 （P<0.01）、磷酸化JAK2 （P<0.05）和磷酸化STAT3 （P<0.05）表达降低,巨噬细胞胞浆和胞核内磷酸化STAT3染色显著减弱,与LPS组比较胞核阳性染色细胞百分比降低（P<0.05）。结论丙酮酸乙酯可减少LPS所致肺泡巨噬细胞细胞因子TNF-αmRNA表达的增加;降低HMGB1的释放,可能是通过抑制LPS引起的磷酸化JAK2和STAT3过量生成而实现的。丙酮酸乙酯可通过减弱内毒素刺激后AM的激活,对脓毒症所致肺损伤起保护作用。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 丙酮酸乙酯对大鼠脓毒症肺损伤的保护效应
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 丙酮酸乙酯对脓毒症肺损伤大鼠高迁移率族蛋白-1 表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 丙酮酸乙酯对脓毒症肺损伤大鼠 JAK2—STAT3 信号通路的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 丙酮酸乙酯对内毒素刺激肺泡巨噬细胞的作用研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 研究结论
• 综述
• 攻读博士学位期间发表文章
• 致谢