检测牛、猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是一种世界范围内流行的家畜疫病,对国家的政治经济具有深远的影响。对口蹄疫的控制,已经形成了比较清晰的防制技术体系:发达国家一般采用扑杀的措施来快速消灭疫病,而大多数发展中国家主要采取疫苗免疫的综合防制措施来防止本病的发生。在疫苗免疫的情况下,利用结构蛋白抗体检测技术难以区分免疫动物与感染动物。非结构蛋白（Non-structure Protein, NSP）抗体检测技术成为公认的鉴别FMD灭活疫苗免疫动物与自然感染动物的有效方法,在许多有FMD疫情的国家得到了广泛的应用,而且成为进出口检疫的必检项目。感染与免疫鉴别诊断技术在疫情调查,筛查隐性感染动物,防制效果评估和建立无FMD感染区方面正在发挥着越来越重要的作用。本研究用特异性的引物扩增出FMDV NSP 3AB基因,将扩增后的产物经回收并与pET-30a载体分别用BamHⅠ和NotⅠ双酶切,连接后构建了pET-30a-3AB重组质粒,经SDS-PAGE和Western blotting分析表达的蛋白为目的蛋白3AB。并制备、纯化3AB蛋白后包被酶标板作为检测抗原。通过检测不同背景的牛、猪血清,确立了该方法的判定标准:样品效价在0.20.25之间为可疑,大于0.25为阳性,小于0.20为阴性。为了检测建立的3AB-I-ELISA方法的敏感性、特异性以及重复性等特征,本研究选用与3ABC-I-ELISA进行对比实验。结果表明:用3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA两种方法检测猪血清的总符合率为98.9%,检测牛血清的总符合率为99.2%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 前言
• 第一部分 文献综述 口蹄疫诊断技术的研究进展
• 1 概述
• 2 FMDV
• 3 FMDV 非结构蛋白及其功能
• pro)'>3.1 前导蛋白酶(L^pro)
• 3.2 2A、28 和2C
• 3.3 3A 和38
• 3.4 3C 蛋白酶（3Cpro）
• pol)'>3.5 3D 聚合酶(3D^pol)
• 4 FMD 诊断技术
• 4.1 病毒分离技术
• 4.1.1 细胞培养
• 4.1.2 动物接种
• 4.2 血清学诊断技术
• 4.2.1 琼脂扩散试验
• 4.2.2 补体结合试验（Complement Fixation Test , CFT）
• 4.2.3 病毒中和试验（Virus Neutralization Test, VNT）
• 4.2.4 间接红细胞凝集试验
• 4.2.5 酶联免疫吸附试验
• 4.3 分子生物学诊断方法
• 4.3.1 核酸探针
• 4.3.2 RT-PCR 技术
• 4.3.3 等电点聚焦电泳技术
• 4.3.4 核酸序列分析
• 4.4 免疫动物和自然感染动物的区分
• 4.4.1 鉴别感染与免疫动物的理论依据
• 4.4.2 FMDV 感染与免疫鉴别诊断研究现状
• 4.4.3 鉴别感染与免疫动物面临的问题与解决方案
• 5 结语
• 第二部分 研究报告
• 第一章 口蹄疫病毒非结构蛋白3AB 基因的可溶性表达与反应原性的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 阳性质粒、细菌菌株及质粒载体
• 1.1.2 血清
• 1.1.3 酶和生物试剂
• 1.1.4 主要仪器与设备
• 1.1.5 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 PCR 扩增
• 1.2.2 PCR 产物的纯化、回收
• 1.2.3 重组表达载体的构建
• 1.2.4 重组质粒的鉴定
• 1.2.5 重组质粒的诱导表达
• 1.2.6 表达产物的检测
• 1.2.7 表达产物的纯化
• 2 结果
• 2.1 PCR
• 2.2 重组质粒的鉴定
• 2.3 表达产物检测
• 2.3.1 SDS-PAGE 电泳
• 2.3.2 Western blotting 分析
• 2.3.3 ELISA 检测
• 3 讨论
• 第二章 牛和猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测3AB-I-ELISA 方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂和材料
• 1.2 3AB 抗原的制备
• 1.3 血清样品
• 1.4 3AB-I-ELISA 操作流程
• 1.5 3AB-I-ELISA 最佳工作条件的确定
• 1.5.1 抗原工作浓度的确定
• 1.5.2 血清稀释度的确定
• 1.5.3 判定标准的确定
• 1.6 3AB 与3ABC 抗原检测结果的比较
• 2 结果与分析
• 2.1 抗原最佳工作浓度
• 2.2 血清稀释度的确定
• 2.3 猪血清非结构蛋白3AB 抗体临界值（cut off 值）和可疑区间的确定
• 2.4 牛血清非结构蛋白抗体临界值（cut off 值）和可疑区间的确定
• 2.5 猪和牛血清的敏感性与特异性及与3ABC-I-ELISA 检测结果的比较
• 3 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介