论文摘要
肠神经系统（enteric nervous system,ENS）是由位于胃肠道壁（包括胰和胆囊）内的神经元、神经递质和蛋白质及其支持细胞所组成的系统,这些神经元起源于神经嵴组织。位于消化道壁内的神经系统主要由2组神经元及其纤维网交织而成,分别是位于纵行肌与环行肌之间的肌间神经丛（auerbach plexus）和位于粘膜层与环行肌之间的粘膜下神经丛（meissner plexus）。前者主要与肠道的运动有关,后者主要与肠道的分泌、吸收功能有关。当肌间神经丛发育障碍时,肠道运动功能不良,可导致便秘等多种临床症状和疾病,如先天性巨结肠（Hirchsprung’s disease, HD）。多瘤促活化因子（Polymoma virus enhancer-3, PEA3）基因属于ETS转录因子基因家族,其编码生成的蛋白在神经嵴细胞的迁移与分化过程中发挥功能,尤其在运动神经元的迁移、分化和发育过程中发挥重要作用。有研究表明,PEA3是胶质细胞源性神经生长因子（glial cell line-derived neurotrophic factor GDNF）的下游作用靶,在GDNF发挥作用中是一个重要因素,在PEA3和GDNF突变型中均观察到相似的神经细胞迁移障碍。同时,以往的研究发现, GDNF表达缺陷使神经前体细胞过早调亡引起肠神经系统的异常,是HD发病的一个重要因素。SOX-10基因是HD发病的敏感基因之一,基因敲除的小鼠表现出HD的多种临床症状。但PEA3蛋白在HD和HAD（先天性巨结肠同源病）的发病过程中是否发挥作用,目前还没有相关报道。我们用免疫组织化学的方法系统探讨PEA3、GDNF蛋白在小鼠结肠肌间神经丛发育过程中的表达及相关性;探讨PEA3蛋白在SOX-10基因敲除小鼠结肠肌间神经丛的表达变化;为进一步探讨HD和HAD的病因提供实验依据。本实验分两个部分对HD和HAD的发病机制进行研究:第一部分采取成年健康雌性昆明小鼠13只,体重50～60g ,与体重80g证实有生育能力的雄性昆明小鼠按一雄一雌于下午四时合笼进行交配,于每天清晨检查发现雌鼠阴道有阴栓者或镜检有大量精子者为交配成功,定为孕1天。分别在孕10、14、19天小鼠各1例取其胚胎结肠组织,石蜡包埋,每一例蜡块每连续切片5张留1张,片厚6微米。免疫组织化学方法:分别以兔抗鼠PEA3单克隆抗体（由SANTA CRUZ公司提供,稀释度1:400）、兔抗鼠GDNF单克隆抗体（由博士德公司提供,稀释度1:100）为一抗,运用免疫组织化学SABC方法,DAB染色。以PBS代替第一抗血清作对照,结果染色阴性。观察PEA3和GDNF蛋白在小鼠结肠肌间神经丛发育过程中的分布,探讨其与HD肠动力障碍发生的关系。第二部分取SOX-10基因敲除小鼠5只分别取其升结肠、乙状结肠,石蜡包埋,取正常小鼠1只作为对照。每一例蜡块做连续切片3张,片厚6微米,依次编号为1、2、3。第一张切片行HE染色,第二张切片行免疫组化染色,第三张切片作甲苯胺蓝特染。免疫组织化学方法同第一部分。观察PEA3蛋白在正常小鼠与SOX-10基因敲除小鼠结肠肌间神经丛分布的差异,以进一步阐述HD肠动力障碍的发病机制。实验结果:第一部分实验中,我们观察到PEA3、GDNF蛋白表达光密度平均值在结肠发育早期较低, GDNF蛋白表达在胚胎发育中期达到峰值,在结肠发育后期下降。PEA3蛋白的表达则随胎龄的增加而增加,且二者在早期和中期不同胚龄小鼠结肠中的表达变化具有一致性。第二部分的实验中,我们观察到在基因敲除小鼠升结肠肌间神经丛中,PEA3阳性细胞数量较正常组变化不明显,细胞中PEA3阳性颗粒的含量减少;在乙状结肠肌间神经丛中观察到PEA3阳性细胞数量较正常组略有下降（P〈0.05）,细胞中PEA3阳性颗粒的含量减少。光密度分析结合统计学分析得出PEA3在基因敲除组与正常组中的表达差异具有显著的统计学意义（P〈0.01）。结果提示:在结肠肌间神经丛发育的早期及中期PEA3和GDNF蛋白的表达变化具有一致性,并且GDNF可能作为PEA3的上游基因表达产物影响其在小鼠结肠发育过程中的表达,PEA3表达缺陷可能是HD和HAD的病因之一。在小鼠结肠肌间神经丛中,PEA3蛋白在结肠肌间神经丛发育过程中发挥作用,且SOX-10基因影响PEA3在这一过程中的表达。
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标签：多瘤促活化因子论文; 胶质细胞源性神经生长因子论文; 免疫组织化学论文;